- Mié Dic 25, 2024 11:49 pm
#860730
desoxirribosa del ácido desoxirribonucleico, Estimulación del crecimiento del cabello en un modelo animal de alopecia androgénica mediante 2-desoxi-D-ribosa
La alopecia androgénica (AGA) afecta tanto a hombres como a mujeres en todo el mundo. La formación de nuevos vasos sanguíneos puede restablecer el suministro de sangre y estimular el ciclo de crecimiento del cabello. Recientemente, nuestro grupo informó que la 2-desoxi-D-ribosa (2dDR) es 80%–90% tan efectiva como el VEGF en la estimulación de la neovascularización en modelos in vitro y en un bioensayo en pollos. En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar el efecto de la 2dDR en el crecimiento del cabello. Preparamos un gel de alginato que contenía 2dDR, polipropilenglicol y fenoxietanol. La AGA se desarrolló en ratones C57BL6 mediante la inyección intraperitoneal de testosterona (TE). Se utilizó un grupo tratado con dihidrotestosterona (DHT) como control negativo, un grupo de minoxidil como control positivo e incluimos grupos tratados con gel 2dDR y una combinación de 2dDR y minoxidil. Cada tratamiento se aplicó durante 20 días. Ambos grupos tratados con gel 2dDR y minoxidil estimularon la morfogénesis de los folículos pilosos. Las secciones de piel teñidas con H&E de ratones C57BL/6 demostraron un aumento en la longitud, el diámetro, la densidad del folículo piloso, la relación anágena/telógena, el diámetro de los folículos pilosos, el área del bulbo piloso cubierta de melanina y un aumento en el número de vasos sanguíneos. La tinción tricrómica de Masson mostró un aumento en el área del bulbo piloso cubierta de melanina. Los efectos del fármaco aprobado por la FDA (minoxidil) en el crecimiento del cabello fueron similares a los del 2dDR (80%–90%). No se observó ningún beneficio significativo al aplicar una combinación de minoxidil con 2dDR. Concluimos que el gel 2dDR tiene potencial para el tratamiento de la alopecia androgénica y posiblemente otras afecciones de alopecia en las que es deseable la estimulación del recrecimiento del cabello, como después de la quimioterapia. El mecanismo de actividad del 2dDR aún está por establecer.
1 Introducción
La alopecia puede ocurrir debido a un desequilibrio hormonal, problemas de tiroides, ciertos medicamentos y enfermedades autoinmunes. Puede ser inducida por medicamentos anticoagulantes, anticonceptivos, antidepresivos, medicamentos antiinflamatorios esteroides, bloqueadores de los canales beta y de calcio, retinoides y quimioterapéuticos ( Vicky et al., 2018 ). La calvicie de patrón masculino, también conocida como alopecia androgénica (AGA), es una de las condiciones de pérdida de cabello más extendidas en el mundo ( Yohei et al., 2018 ). En la fisiopatología de la AGA, la testosterona se convierte en dihidrotestosterona (DHT) por la 5α-reductasa. Luego, la DHT se une a los receptores de andrógenos en las células de la papila dérmica (DPC) de los folículos pilosos sensibles y prolonga la fase telógena, lo que provoca la caída del cabello antes del crecimiento de cabello nuevo ( Izabela et al., 2014 ). Se dice que la AGA afecta al 30% de los hombres asiáticos a los 30 años y al 50% a los 50 ( Yohei et al., 2018 ). También afecta al 80% de los hombres blancos y al 40% de las mujeres blancas a los 70 años ( Pietro et al., 2019 ). Las inyecciones de plasma rico en plaquetas (PRP), los medicamentos tópicos, los medicamentos orales y las operaciones de trasplante de cabello se están utilizando actualmente para tratar la AGA ( Alfredo et al., 2016 ). Actualmente, el minoxidil y la finasterida son los únicos medicamentos aprobados por la FDA que se utilizan para tratar la AGA. El minoxidil facilita el crecimiento del cabello al facilitar la supervivencia de la DP y expandir la fase anágena ( Hyun et al., 2004 ). La finasterida estimula el crecimiento de cabello nuevo al suprimir la actividad de la 5α-reductasa ( Libecco y Bergfeld, 2004 ). Ambos medicamentos tienen efectos secundarios; Por ejemplo, se ha informado que la finasterida reduce el deseo sexual, mientras que el minoxidil puede desencadenar infarto anteroseptal agudo, infarto de miocardio y anorexia ( Hiroshi et al., 2000 ; Vesoulis et al., 2014 ).
El minoxidil suele provocar la caída temprana de los cabellos que ya están en la fase telógena (efluvio telógeno) debido al acortamiento de la fase telógena antes de renovar el crecimiento del cabello sano. Esto requiere la aplicación a largo plazo de minoxidil para un efecto sostenido ( Alfredo et al., 2012 ). Los efectos secundarios comunes del minoxidil tópico son dermatológicos, como dermatitis de contacto, prurito y eritema. Hasta la fecha, solo hay un informe de caso de insuficiencia cardíaca con el uso de minoxidil tópico ( Hiroshi et al., 2000 ; Friedman et al., 2002 ). Muchas moléculas de señalización intracelular estimulan la proliferación de células papilares dérmicas, incluidas las quinasas y los factores de crecimiento, y, por lo tanto, desempeñan un papel esencial en la estimulación del crecimiento del cabello. La proteína de señalización factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se secreta desde el epitelio vascular y estimula la angiogénesis a través de vías intracelulares. Esto extiende la red vascular que rodea el folículo piloso, lo que favorece el recrecimiento del cabello ( Mauro et al., 2001 ; Choi, 2018 ). Shin et al. demostraron que Rg3 (uno de los principales componentes del Panax ginseng ) estimulaba los niveles de ARNm del VEGF al mismo tiempo que aumentaba la proliferación de células papilares dérmicas humanas. Rg3 activó las células madre en los folículos pilosos de ratones in vivo al regular positivamente el factor activador CD34 y se descubrió que promovía el crecimiento del cabello mejor que el minoxidil ( Hyun et al., 2014 ). En teoría, cualquier agente que pueda estimular la producción de VEGF podría ser útil en la regeneración del cabello en la fase telógena.
La 2-desoxi-D-ribosa (2dDR) es un isómero D de un monosacárido desoxipentosa, en el que está presente un átomo de hidrógeno con un grupo hidroxilo en la posición C-2, en lugar del grupo hidroxilo. Se sabe que la 2dDR mejora la tubulogénesis ( Ikeda et al., 2006 ), previene la apoptosis inducida por hipoxia ( Yuichi et al., 2004 ) y aumenta la producción de VEGF e IL-8 ( Serkan et al., 2021 ) de las CE in vitro , lo que es consistente con los efectos estimulantes de la 2dDR sobre la proliferación y migración celular. Nuestro grupo ha descubierto que la 2dDR estimula la angiogénesis, la proliferación de células endoteliales y acelera la cicatrización de heridas en modelos de rata ( Yar et al., 2017 ). Estos estudios ( Yar et al., 2017 ; Serkan et al., 2019 ; Anisa et al., 2020 ; Serkan et al., 2020 ; Serkan et al., 2021 ) en conjunto hacen una contribución sustancial a la comprensión de la actividad biológica (proangiogénica) de 2dDR. Además, hemos demostrado que 2dDR se puede cargar en varios biomateriales para una liberación prolongada durante varios días para promover el crecimiento de los vasos sanguíneos neonatales ( Yar et al., 2017 ; Maryam et al., 2019 ; Serkan et al., 2021 ). El alginato de sodio, una macromolécula biodegradable, no tóxica y soluble en agua, es un polímero ideal para geles ( Wang y Wang, 2010 ). El propilenglicol (PG) es un líquido viscoso utilizado en sistemas de administración farmacológica por su penetración hidrofílica y sus propiedades antisépticas ( Mujica et al., 2016 ). Mejora el tiempo de retención de líquidos en hidrogeles e interactúa con los lípidos intercelulares para la penetración de la barrera del estrato córneo ( Trommer y Neubert, 2006 ; Victor et al., 2020 ). El fenoxietanol es un estabilizador y agente antimicrobiano aprobado, que previene la contaminación en hidrogeles ( Nolan y Nolan, 1972 ).
Nuestro objetivo en el presente estudio fue investigar si la administración de 2dDR a partir de hidrogeles estimularía la regeneración del cabello a través de la angiogénesis. Para este estudio, preparamos hidrogeles que comprendían alginato de sodio y propilenglicol, con fenoxietanol añadido como estabilizador (blanco-SA). Se descubrió que los hidrogeles 2dDR-SA, cuando se suplementaban con 2dDR, mostraban un crecimiento sostenido del cabello en ratones AGA, lo que demuestra que el hidrogel 2dDR-SA es un posible agente terapéutico para el tratamiento de la AGA.
2 Materiales y métodos
2.1 Materiales
El alginato de sodio (n.º de cat. 7528-1405) con un peso molecular de 120 000–190 000 g/mol se adquirió de Daejung Chemicals, Corea. El propilenglicol (99,5 % puro; n.º de cat. 24300-11000PE) se adquirió de Penta Chemicals Limited, República Checa. El 2-fenoxietanol (94 % puro; n.º de cat. A10786.30) se adquirió de Alfa Aesar, Estados Unidos. El azúcar 2-desoxi-D-ribosa (n.º de cat. 00613) se adquirió de Chem-Impex International, Estados Unidos. El minoxidil (Hair Max ® 2 %) se adquirió de Sante (Private) Limited, Karachi, Pakistán, y el enantato de testosterona (nombre comercial Testoviron Depot ® ) se adquirió de BAYER Pharmaceuticals, Alemania. En el proceso de fabricación de la presente investigación se utilizó agua desionizada esterilizada en autoclave. Todos los productos químicos y reactivos eran de grado analítico y se utilizaron sin purificación adicional.
2.2 Preparación de hidrogeles de control y cargados con 2dDR
Se prepararon dos hidrogeles diferentes, SA en blanco y SA 2dDR, mediante una simple mezcla manual de los componentes en agua esterilizada en autoclave a temperatura ambiente utilizando una espátula. El hidrogel SA en blanco estaba compuesto por 1,4 g de alginato de sodio (6,4 % p/p), 250 mg de propilenglicol (1,15 % p/p) y 82,5 mg de 2-fenoxietanol (0,377 % p/p) como estabilizador en 20 ml de agua. El hidrogel 2dDR-SA estaba compuesto por 1,4 g de alginato de sodio (6,416 % p/p), 250 mg de propilenglicol (1,146 % p/p), 82,5 mg de 2-fenoxietanol (0,375 % p/p) y 86,62 mg de azúcar 2-desoxi-D-ribosa (0,394 % p/p) en 20 ml de agua. Los hidrogeles preparados (blanco-SA y 2dDR-SA) se almacenaron en viales de vidrio a temperatura ambiente.
Para los estudios de liberación de FTIR y 2dDR, se vertieron 10 ml de hidrogeles de SA en blanco y 10 ml de SA en 2dDR en placas de Petri (100 × 15 mm) y se cubrieron con una lámina de aluminio perforada. Se congelaron a -20 °C durante 20 h y luego se colocaron en la FreeZone de Labconco (4,5 L) a -105 °C durante 24 h. Estos hidrogeles liofilizados (FD-SA en blanco y FD-2dDR-SA) se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se usaron para los análisis.
2.3 Análisis por espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)
La técnica FTIR se utiliza para estimar el patrón de interferencia de emisión o absorción de una muestra. Las características químicas del hidrogel 2dDR fabricado a base de alginato de sodio y del gel en blanco de alginato de sodio se observaron en un sistema de análisis espectroscópico (FTIR) en el rango de frecuencia de 4000 a 400 cm −1 con 256 escaneos secuenciales a 8 cm −1 en un modo de fotoaudio, que es una forma de examinar materiales sin preparación de la muestra (espectrómetro Thermo Nicolet 6700P, Estados Unidos).
2.4 Análisis de la liberación de 2dDR del hidrogel 2dDR-SA
La liberación de 2dDR del hidrogel 2dDR-SA se determinó cuantitativamente mediante el ensayo de difenilamina de Dische ( Jennifer y Mura, 2013 ). Se preparó una solución madre del reactivo de Dische disolviendo 0,75 g de difenilamina en una solución de 50 ml de ácido acético glacial suplementado con 750 µL de ácido sulfúrico concentrado en condiciones de oscuridad. Se preparó una solución nueva de etanol al 2 % v/v en agua destilada para el ensayo y se añadieron 50 µL de la solución de etanol a 10 ml de la solución de difenilamina.
El hidrogel 2dDR-SA secado a temperatura ambiente se cortó en parches de 2 × 2 cm y se sumergió en PBS en una placa de seis pocillos en un entorno estéril. La placa se selló herméticamente con Parafilm para evitar la evaporación del PBS y se incubó a 37 °C y 55 % de humedad. La liberación de 2dDR se controló en diferentes puntos de tiempo (4 h y 1 d, 2 d, 3 d, 4 d y 7 d). En cada punto de tiempo, se extrajo el medio de liberación (PBS) de cada pocillo y se reemplazó con medio fresco. Se agregó reactivo de Dische (500 µL) a 500 µL de medio de liberación y se incubó durante 10 min a 100 °C. Luego, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 min antes de centrifugarlas a 10 000 rpm durante 5 min. Se midió la absorbancia del sobrenadante resultante a 590 nm. La concentración de 2dDR liberado se obtuvo a partir de una curva de calibración de diluciones conocidas de 2dDR. Se calculó la liberación acumulada del fármaco en función del tiempo.
2.5 Desarrollo del modelo de alopecia androgénica en ratones macho C57BL/6 y prueba de hidrogeles de SA en blanco y 2dDR-SA contra la alopecia androgénica
Se adquirieron ratones machos C57BL/6 de siete semanas de edad en el Centro de Excelencia en Biología Molecular de la Universidad de Punjab, Lahore (Pakistán). Los ratones se alojaron en jaulas de plástico a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C) en ciclos controlados de luz/oscuridad de 12 h/12 h y se alimentaron con pienso estándar para ratones y agua ad libitum . Se aclimataron al entorno de laboratorio durante una semana. Se siguieron todos los principios del cuidado de los animales de laboratorio en el Centro de Investigación Preclínica, IRCBM, CUI, Lahore, y todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Comité de Ética de la CUI, Lahore, con el certificado de aprobación ética número EC/MY/007/22.
En resumen, los animales se dividieron aleatoriamente en seis grupos de tres ratones en cada NC y T-1, mientras que cuatro en los otros cuatro grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se denominaron T1-T5, como se describe en la Tabla 1. El modelo de alopecia androgénica se desarrolló en ratones C57BL/6 mediante la inyección intraperitoneal de enantato de testosterona a 0,1 ml de 5 mg/ml (20 mg/kg) tres veces por semana durante 2 semanas, como se describió previamente en la literatura, con ligeras modificaciones ( Fu et al., 2021 ). Después de 2 semanas, se depiló el pelo de la piel de la espalda tratada (2 × 3 cm) de los ratones utilizando una crema depilatoria bajo anestesia general con ketamina a 80 mg/kg I/P y xilazina a 10 mg@/kg I/P. Se aplicaron aproximadamente 0,5 ml de cada hidrogel (SA en blanco y SA 2dDR) por vía tópica en el lado dorsal de los ratones (2 × 3 cm) una vez al día durante 20 días, y el experimento finalizó el día 21. Se tomaron fotografías digitales los días 0, 7, 14 y 21 utilizando una cámara DSLR. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical antes de recolectar muestras de pelo y tejido.
Podéis leer el estudio completo en la fuente, sólo dejo un trozo inicial. Sabemos algo sobre esto?
https://www.frontiersin.org/journals/ph ... 70833/full
La alopecia androgénica (AGA) afecta tanto a hombres como a mujeres en todo el mundo. La formación de nuevos vasos sanguíneos puede restablecer el suministro de sangre y estimular el ciclo de crecimiento del cabello. Recientemente, nuestro grupo informó que la 2-desoxi-D-ribosa (2dDR) es 80%–90% tan efectiva como el VEGF en la estimulación de la neovascularización en modelos in vitro y en un bioensayo en pollos. En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar el efecto de la 2dDR en el crecimiento del cabello. Preparamos un gel de alginato que contenía 2dDR, polipropilenglicol y fenoxietanol. La AGA se desarrolló en ratones C57BL6 mediante la inyección intraperitoneal de testosterona (TE). Se utilizó un grupo tratado con dihidrotestosterona (DHT) como control negativo, un grupo de minoxidil como control positivo e incluimos grupos tratados con gel 2dDR y una combinación de 2dDR y minoxidil. Cada tratamiento se aplicó durante 20 días. Ambos grupos tratados con gel 2dDR y minoxidil estimularon la morfogénesis de los folículos pilosos. Las secciones de piel teñidas con H&E de ratones C57BL/6 demostraron un aumento en la longitud, el diámetro, la densidad del folículo piloso, la relación anágena/telógena, el diámetro de los folículos pilosos, el área del bulbo piloso cubierta de melanina y un aumento en el número de vasos sanguíneos. La tinción tricrómica de Masson mostró un aumento en el área del bulbo piloso cubierta de melanina. Los efectos del fármaco aprobado por la FDA (minoxidil) en el crecimiento del cabello fueron similares a los del 2dDR (80%–90%). No se observó ningún beneficio significativo al aplicar una combinación de minoxidil con 2dDR. Concluimos que el gel 2dDR tiene potencial para el tratamiento de la alopecia androgénica y posiblemente otras afecciones de alopecia en las que es deseable la estimulación del recrecimiento del cabello, como después de la quimioterapia. El mecanismo de actividad del 2dDR aún está por establecer.
1 Introducción
La alopecia puede ocurrir debido a un desequilibrio hormonal, problemas de tiroides, ciertos medicamentos y enfermedades autoinmunes. Puede ser inducida por medicamentos anticoagulantes, anticonceptivos, antidepresivos, medicamentos antiinflamatorios esteroides, bloqueadores de los canales beta y de calcio, retinoides y quimioterapéuticos ( Vicky et al., 2018 ). La calvicie de patrón masculino, también conocida como alopecia androgénica (AGA), es una de las condiciones de pérdida de cabello más extendidas en el mundo ( Yohei et al., 2018 ). En la fisiopatología de la AGA, la testosterona se convierte en dihidrotestosterona (DHT) por la 5α-reductasa. Luego, la DHT se une a los receptores de andrógenos en las células de la papila dérmica (DPC) de los folículos pilosos sensibles y prolonga la fase telógena, lo que provoca la caída del cabello antes del crecimiento de cabello nuevo ( Izabela et al., 2014 ). Se dice que la AGA afecta al 30% de los hombres asiáticos a los 30 años y al 50% a los 50 ( Yohei et al., 2018 ). También afecta al 80% de los hombres blancos y al 40% de las mujeres blancas a los 70 años ( Pietro et al., 2019 ). Las inyecciones de plasma rico en plaquetas (PRP), los medicamentos tópicos, los medicamentos orales y las operaciones de trasplante de cabello se están utilizando actualmente para tratar la AGA ( Alfredo et al., 2016 ). Actualmente, el minoxidil y la finasterida son los únicos medicamentos aprobados por la FDA que se utilizan para tratar la AGA. El minoxidil facilita el crecimiento del cabello al facilitar la supervivencia de la DP y expandir la fase anágena ( Hyun et al., 2004 ). La finasterida estimula el crecimiento de cabello nuevo al suprimir la actividad de la 5α-reductasa ( Libecco y Bergfeld, 2004 ). Ambos medicamentos tienen efectos secundarios; Por ejemplo, se ha informado que la finasterida reduce el deseo sexual, mientras que el minoxidil puede desencadenar infarto anteroseptal agudo, infarto de miocardio y anorexia ( Hiroshi et al., 2000 ; Vesoulis et al., 2014 ).
El minoxidil suele provocar la caída temprana de los cabellos que ya están en la fase telógena (efluvio telógeno) debido al acortamiento de la fase telógena antes de renovar el crecimiento del cabello sano. Esto requiere la aplicación a largo plazo de minoxidil para un efecto sostenido ( Alfredo et al., 2012 ). Los efectos secundarios comunes del minoxidil tópico son dermatológicos, como dermatitis de contacto, prurito y eritema. Hasta la fecha, solo hay un informe de caso de insuficiencia cardíaca con el uso de minoxidil tópico ( Hiroshi et al., 2000 ; Friedman et al., 2002 ). Muchas moléculas de señalización intracelular estimulan la proliferación de células papilares dérmicas, incluidas las quinasas y los factores de crecimiento, y, por lo tanto, desempeñan un papel esencial en la estimulación del crecimiento del cabello. La proteína de señalización factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se secreta desde el epitelio vascular y estimula la angiogénesis a través de vías intracelulares. Esto extiende la red vascular que rodea el folículo piloso, lo que favorece el recrecimiento del cabello ( Mauro et al., 2001 ; Choi, 2018 ). Shin et al. demostraron que Rg3 (uno de los principales componentes del Panax ginseng ) estimulaba los niveles de ARNm del VEGF al mismo tiempo que aumentaba la proliferación de células papilares dérmicas humanas. Rg3 activó las células madre en los folículos pilosos de ratones in vivo al regular positivamente el factor activador CD34 y se descubrió que promovía el crecimiento del cabello mejor que el minoxidil ( Hyun et al., 2014 ). En teoría, cualquier agente que pueda estimular la producción de VEGF podría ser útil en la regeneración del cabello en la fase telógena.
La 2-desoxi-D-ribosa (2dDR) es un isómero D de un monosacárido desoxipentosa, en el que está presente un átomo de hidrógeno con un grupo hidroxilo en la posición C-2, en lugar del grupo hidroxilo. Se sabe que la 2dDR mejora la tubulogénesis ( Ikeda et al., 2006 ), previene la apoptosis inducida por hipoxia ( Yuichi et al., 2004 ) y aumenta la producción de VEGF e IL-8 ( Serkan et al., 2021 ) de las CE in vitro , lo que es consistente con los efectos estimulantes de la 2dDR sobre la proliferación y migración celular. Nuestro grupo ha descubierto que la 2dDR estimula la angiogénesis, la proliferación de células endoteliales y acelera la cicatrización de heridas en modelos de rata ( Yar et al., 2017 ). Estos estudios ( Yar et al., 2017 ; Serkan et al., 2019 ; Anisa et al., 2020 ; Serkan et al., 2020 ; Serkan et al., 2021 ) en conjunto hacen una contribución sustancial a la comprensión de la actividad biológica (proangiogénica) de 2dDR. Además, hemos demostrado que 2dDR se puede cargar en varios biomateriales para una liberación prolongada durante varios días para promover el crecimiento de los vasos sanguíneos neonatales ( Yar et al., 2017 ; Maryam et al., 2019 ; Serkan et al., 2021 ). El alginato de sodio, una macromolécula biodegradable, no tóxica y soluble en agua, es un polímero ideal para geles ( Wang y Wang, 2010 ). El propilenglicol (PG) es un líquido viscoso utilizado en sistemas de administración farmacológica por su penetración hidrofílica y sus propiedades antisépticas ( Mujica et al., 2016 ). Mejora el tiempo de retención de líquidos en hidrogeles e interactúa con los lípidos intercelulares para la penetración de la barrera del estrato córneo ( Trommer y Neubert, 2006 ; Victor et al., 2020 ). El fenoxietanol es un estabilizador y agente antimicrobiano aprobado, que previene la contaminación en hidrogeles ( Nolan y Nolan, 1972 ).
Nuestro objetivo en el presente estudio fue investigar si la administración de 2dDR a partir de hidrogeles estimularía la regeneración del cabello a través de la angiogénesis. Para este estudio, preparamos hidrogeles que comprendían alginato de sodio y propilenglicol, con fenoxietanol añadido como estabilizador (blanco-SA). Se descubrió que los hidrogeles 2dDR-SA, cuando se suplementaban con 2dDR, mostraban un crecimiento sostenido del cabello en ratones AGA, lo que demuestra que el hidrogel 2dDR-SA es un posible agente terapéutico para el tratamiento de la AGA.
2 Materiales y métodos
2.1 Materiales
El alginato de sodio (n.º de cat. 7528-1405) con un peso molecular de 120 000–190 000 g/mol se adquirió de Daejung Chemicals, Corea. El propilenglicol (99,5 % puro; n.º de cat. 24300-11000PE) se adquirió de Penta Chemicals Limited, República Checa. El 2-fenoxietanol (94 % puro; n.º de cat. A10786.30) se adquirió de Alfa Aesar, Estados Unidos. El azúcar 2-desoxi-D-ribosa (n.º de cat. 00613) se adquirió de Chem-Impex International, Estados Unidos. El minoxidil (Hair Max ® 2 %) se adquirió de Sante (Private) Limited, Karachi, Pakistán, y el enantato de testosterona (nombre comercial Testoviron Depot ® ) se adquirió de BAYER Pharmaceuticals, Alemania. En el proceso de fabricación de la presente investigación se utilizó agua desionizada esterilizada en autoclave. Todos los productos químicos y reactivos eran de grado analítico y se utilizaron sin purificación adicional.
2.2 Preparación de hidrogeles de control y cargados con 2dDR
Se prepararon dos hidrogeles diferentes, SA en blanco y SA 2dDR, mediante una simple mezcla manual de los componentes en agua esterilizada en autoclave a temperatura ambiente utilizando una espátula. El hidrogel SA en blanco estaba compuesto por 1,4 g de alginato de sodio (6,4 % p/p), 250 mg de propilenglicol (1,15 % p/p) y 82,5 mg de 2-fenoxietanol (0,377 % p/p) como estabilizador en 20 ml de agua. El hidrogel 2dDR-SA estaba compuesto por 1,4 g de alginato de sodio (6,416 % p/p), 250 mg de propilenglicol (1,146 % p/p), 82,5 mg de 2-fenoxietanol (0,375 % p/p) y 86,62 mg de azúcar 2-desoxi-D-ribosa (0,394 % p/p) en 20 ml de agua. Los hidrogeles preparados (blanco-SA y 2dDR-SA) se almacenaron en viales de vidrio a temperatura ambiente.
Para los estudios de liberación de FTIR y 2dDR, se vertieron 10 ml de hidrogeles de SA en blanco y 10 ml de SA en 2dDR en placas de Petri (100 × 15 mm) y se cubrieron con una lámina de aluminio perforada. Se congelaron a -20 °C durante 20 h y luego se colocaron en la FreeZone de Labconco (4,5 L) a -105 °C durante 24 h. Estos hidrogeles liofilizados (FD-SA en blanco y FD-2dDR-SA) se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se usaron para los análisis.
2.3 Análisis por espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)
La técnica FTIR se utiliza para estimar el patrón de interferencia de emisión o absorción de una muestra. Las características químicas del hidrogel 2dDR fabricado a base de alginato de sodio y del gel en blanco de alginato de sodio se observaron en un sistema de análisis espectroscópico (FTIR) en el rango de frecuencia de 4000 a 400 cm −1 con 256 escaneos secuenciales a 8 cm −1 en un modo de fotoaudio, que es una forma de examinar materiales sin preparación de la muestra (espectrómetro Thermo Nicolet 6700P, Estados Unidos).
2.4 Análisis de la liberación de 2dDR del hidrogel 2dDR-SA
La liberación de 2dDR del hidrogel 2dDR-SA se determinó cuantitativamente mediante el ensayo de difenilamina de Dische ( Jennifer y Mura, 2013 ). Se preparó una solución madre del reactivo de Dische disolviendo 0,75 g de difenilamina en una solución de 50 ml de ácido acético glacial suplementado con 750 µL de ácido sulfúrico concentrado en condiciones de oscuridad. Se preparó una solución nueva de etanol al 2 % v/v en agua destilada para el ensayo y se añadieron 50 µL de la solución de etanol a 10 ml de la solución de difenilamina.
El hidrogel 2dDR-SA secado a temperatura ambiente se cortó en parches de 2 × 2 cm y se sumergió en PBS en una placa de seis pocillos en un entorno estéril. La placa se selló herméticamente con Parafilm para evitar la evaporación del PBS y se incubó a 37 °C y 55 % de humedad. La liberación de 2dDR se controló en diferentes puntos de tiempo (4 h y 1 d, 2 d, 3 d, 4 d y 7 d). En cada punto de tiempo, se extrajo el medio de liberación (PBS) de cada pocillo y se reemplazó con medio fresco. Se agregó reactivo de Dische (500 µL) a 500 µL de medio de liberación y se incubó durante 10 min a 100 °C. Luego, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 min antes de centrifugarlas a 10 000 rpm durante 5 min. Se midió la absorbancia del sobrenadante resultante a 590 nm. La concentración de 2dDR liberado se obtuvo a partir de una curva de calibración de diluciones conocidas de 2dDR. Se calculó la liberación acumulada del fármaco en función del tiempo.
2.5 Desarrollo del modelo de alopecia androgénica en ratones macho C57BL/6 y prueba de hidrogeles de SA en blanco y 2dDR-SA contra la alopecia androgénica
Se adquirieron ratones machos C57BL/6 de siete semanas de edad en el Centro de Excelencia en Biología Molecular de la Universidad de Punjab, Lahore (Pakistán). Los ratones se alojaron en jaulas de plástico a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C) en ciclos controlados de luz/oscuridad de 12 h/12 h y se alimentaron con pienso estándar para ratones y agua ad libitum . Se aclimataron al entorno de laboratorio durante una semana. Se siguieron todos los principios del cuidado de los animales de laboratorio en el Centro de Investigación Preclínica, IRCBM, CUI, Lahore, y todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Comité de Ética de la CUI, Lahore, con el certificado de aprobación ética número EC/MY/007/22.
En resumen, los animales se dividieron aleatoriamente en seis grupos de tres ratones en cada NC y T-1, mientras que cuatro en los otros cuatro grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se denominaron T1-T5, como se describe en la Tabla 1. El modelo de alopecia androgénica se desarrolló en ratones C57BL/6 mediante la inyección intraperitoneal de enantato de testosterona a 0,1 ml de 5 mg/ml (20 mg/kg) tres veces por semana durante 2 semanas, como se describió previamente en la literatura, con ligeras modificaciones ( Fu et al., 2021 ). Después de 2 semanas, se depiló el pelo de la piel de la espalda tratada (2 × 3 cm) de los ratones utilizando una crema depilatoria bajo anestesia general con ketamina a 80 mg/kg I/P y xilazina a 10 mg@/kg I/P. Se aplicaron aproximadamente 0,5 ml de cada hidrogel (SA en blanco y SA 2dDR) por vía tópica en el lado dorsal de los ratones (2 × 3 cm) una vez al día durante 20 días, y el experimento finalizó el día 21. Se tomaron fotografías digitales los días 0, 7, 14 y 21 utilizando una cámara DSLR. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical antes de recolectar muestras de pelo y tejido.
Podéis leer el estudio completo en la fuente, sólo dejo un trozo inicial. Sabemos algo sobre esto?
https://www.frontiersin.org/journals/ph ... 70833/full
