- Sab Mar 15, 2014 4:00 am
#400680
Ácido valproico induce la regeneración del cabello en el modelo murino y activa la fosfatasa alcalina actividad en las células humanas papila dérmica
Abstracto
Fondo
La alopecia es la pérdida del cabello problema común que puede afectar a muchas personas. Sin embargo, las terapias actuales para el tratamiento de la alopecia están limitados por la baja eficacia y los efectos secundarios potencialmente indeseables. Hemos identificado una nueva función para el ácido valproico (VPA), un inhibidor de GSK3 que activa el / β-catenina vía Wnt, para promover el crecimiento de cabello in vitro e in vivo .
Metodología / Principales conclusiones
La aplicación tópica de VPA a ratones C3H varones estimulado críticamente el crecimiento de cabello e indujo marcadores epidérmicas terminales diferenciadas como filagrina y loricrina, y la fosfatasa papila dérmica marcador alcalina (ALP). VPA indujo ALP en las células de la papila dérmica humanos hasta la regulación de la / β-catenina vía Wnt, mientras que el minoxidil (MNX), un fármaco comúnmente utilizado para tratar la alopecia, no afectó significativamente el / β-catenina vía Wnt. Análogos de VPA y otros inhibidores de GSK3 que activan el / β-catenina vía Wnt, como el ácido 4-fenil butírico, LiCl, y BeCl 2 actividades que promueven el crecimiento del pelo también exhibidos en vivo . Es importante destacar que, VPA, pero no MNX, estimular con éxito el crecimiento del vello en las heridas de los ratones C3H.
Conclusiones / Importancia
Nuestros resultados indican que las pequeñas moléculas que activan el / β-catenina vía Wnt, como VPA, potencialmente se pueden desarrollar como fármacos para estimular el crecimiento de cabello.
Cifras
Introducción
La alopecia provoca graves problemas a muchas personas en el mundo. Sin embargo, las terapias actuales para el tratamiento de la alopecia están limitados por la baja eficacia y los efectos secundarios potencialmente indeseables causados por la aplicación de los fármacos disponibles [1] . El / β-catenina vía de Wnt es importante para varios procesos de desarrollo, incluyendo el desarrollo del folículo piloso [2] - [4] . La activación es necesaria de la / vía de β-catenina vía para la iniciación de la formación de folículo piloso [5] , y estimula el crecimiento y la diferenciación del pelo por mantenimiento de la expresión de genes que funcionan en la fase anágena del ciclo del pelo [6] . Wnt3a y Wnt7a mantienen papilas dérmicas en la fase anágena como señales inductivas para el crecimiento del cabello [6] . Además, β-catenina se acumula en los núcleos de las papilas dérmicas, durante la fase anágena, y proporciona señales de crecimiento para células progenitoras del folículo piloso [7] , [8] . Finalmente, el / β-catenina vía de Wnt desempeña un papel en la diferenciación de células madre en los queratinocitos foliculares del cabello [9] . Juntos, estos hallazgos indican que el / vía de β-catenina Wnt podría ser una diana ideal para el desarrollo de fármacos que activan el crecimiento del cabello mediante la inducción de genes de fase anágena. Por desgracia, actualmente no hay medicamentos que se sabe que estimulan el crecimiento del cabello apuntando el / β-catenina vía Wnt.
El ácido valproico (VPA, ácido 2-propil-pentanoico) es un estabilizador del ánimo comúnmente prescrito para el tratamiento de la epilepsia y el trastorno bipolar en los últimos decenios [10] , [11] . VPA es conocido como un inhibidor de histona desacetilasa que ejerce sus efectos a través de la modificación de la estructura de la cromatina y la expresión de genes [12] , [13] . VPA también se sabe que afecta a varias vías de señalización diferentes, incluyendo la proteína quinasa C, la señal extracelular-quinasa regulada (ERK), y Wnt / β-catenina vías [14] - [16] . VPA activa el / vía β-catenina vía mediante la inhibición de GSK3 [17] , [18] , lo que conduce a la remodelación axonal, la agrupación de proteína sináptica, y la diferenciación de células progenitoras neuronales [19] , [20] .
Se investigó el efecto de VPA en el nuevo crecimiento del pelo de los ratones C3H considerando la relación entre el / β-catenina vía Wnt y la formación de cabello. VPA induce el crecimiento de cabello tan eficientemente como MNX y activó el / β-catenina vía Wnt in vivo . La importancia potencial de VPA en la re-crecimiento del cabello humano se indicó por el aumento de la expresión de ALP y la activación de la vía Wnt / β-catenina tras el tratamiento de VPA en células de la papila dérmica humanos. La fosfatasa alcalina (ALP), un prominente marcador de papila dérmica [21] - [23] , fue identificado como un marcador crítico para la promoción del crecimiento del pelo. El papel del / β-catenina vía Wnt en la regulación de la actividad de ALP se procedió a investigar mediante pruebas de análogos de VPA y otros activadores Wnt in vivo e in vitro . Por último, se caracterizaron más funciones específicas de VPA en el crecimiento del cabello inducida en las heridas de los ratones C3H. Estos efectos de VPA que acompañan a la activación de la queratina 15 y CD34 marcadores de células madre también se correlacionan con la / β-catenina vía de Wnt y actividades de ALP.
Materiales y Métodos
Reactivos
VPA, 4-fenil butírico (PBA), y ácido butírico 2-etil (EBA) se adquirieron de Acros. El cloruro de litio (LiCl) y cloruro de berilio (BeCl 2 ) fueron adquiridos de Sigma, y MNX se adquirió de Daejung.
Animales y en Vivo Ensayo de Crecimiento del Cabello
Seis semanas de edad ratones C3H masculinos fueron adquiridos de Orient Bio Co., y se les permite adaptarse a su nuevo ambiente durante 1 semana. Los pelos de la espalda de ratones 7 semanas de edad, cuyo cabello folículos se encontraban en fase de telógeno, se afeitó con una cortadora de cabello y 300 l de cada fármaco a una concentración apropiada (como se describe en leyendas de las figuras) se aplicó tópicamente al día hasta a 28 d. Todos los reactivos utilizados en el ensayo de re-crecimiento del cabello se disolvieron en un vehículo compuesto por 50% (vol / vol) de etanol, 30% de agua, y 20% de glicol de propileno. TOP-GAL ratones transgénicos que llevan el lac Z gen reportero de aguas abajo de la de c-fos promotor que responde a la potenciador linfoide factor de unión 1/transcription factor de 3 (LEF / TCF) vía de señalización mediada y activado β-catenina se adquirieron en el Jackson Laboratory . La genotipificación se confirmó por reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR) utilizando los siguientes cebadores: transgén hacia adelante 5'-ATCCTCTGCATGGTCAGGTC-3 ' , transgén inversa 5'-CGTGGCCTGATTCATTCC-3 ' ; control positivo interno hacia adelante 5'-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3 ' , positivo interno control de revertir 5'-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3 ' . Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Severance, Yonsei University College of Medicine (09-013).
Cuantitativa Histomorfometría
Fases del ciclo del pelo, y se distribuyeron como se describe [24] por medio de histología cuantitativa. Histomorphomety se realizó con secciones de hematoxilina y eosina-manchado (H & E) que fueron tomadas de las regiones definidas de nuevo en la piel. Se evaluaron al menos 50 folículos pilosos por ratón por grupo.
Cultivo Celular
Células de la papila dérmica Humanos se obtuvieron del Dr. Jin-Ho Jung en el Departamento de Dermatología de la Universidad Nacional de Seúl, y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% (vol / vol) de suero bovino fetal (FBS) y suplementado con G418 0,1 mg / ml (Gibco-BRL). Las células se colocaron en placas a una densidad de 6 × 10 5 células por placa de 10 cm de diámetro.
Análisis de transferencia Western
Las células o tejido que se molió en morteros se lisaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,2, 0,1% de sodio dodecil sulfato (SDS), 1,0% de Triton X-100, desoxicolato de sodio al 1%, EDTA 5 mM) . Las muestras fueron separadas en 10-12% SDS geles de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa PROTRAN ® (Schleicher y Schuell Co.). Después de bloquear en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 5% de leche sin grasa seca desnatada y 0,07% (vol / vol) de Tween 20, los blots se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C: anti-β-catenina ( Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), p-ERK (Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), p-Akt (Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), fillagrin (Covance, Berkeley, CA, 1:1000), loricrina ( Covance, 1:1000), queratina 14 (Covance, 1:1000), α-tubulina (Oncogene Research Products, 1:5000), PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes, Santa Cruz Biotechnology, 1:500), BMP4 (I + D sistemas, 1:500), y ALP (Abcam, 1:100). Anti-ratón (Señalización Celular) y anti-conejo (Bio-Rad) anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante se usaron como anticuerpos secundarios. Las señales se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham Bioscience) usando un analizador de imágenes luminiscentes, LAS-3000 (Fujifilm).
La transcripción inversa (RT)-PCR
Se preparó ARN total utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) y el ADNc se sintetizó in vitro utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen). PCR se realizó con Taq ADN polimerasa utilizando un sistema 2700 (Applied Biosystems) a 94 ° C durante 5 min, seguido de 25-30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 55-60 º C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y se fotografiaron usando un analizador de LAS-3000. Se utilizaron los siguientes conjuntos de cebadores: filagrina, adelante 5'-GCTTAAATGCATCTCCAG-3 ' y revertir 5'-AGTCAGTCCTATTGCAGG-3 ' ; loricrina, adelante 5'-CCTACCTGGCCGTGCAAG-3 ' y revertir 5'-CATGAGAAAGTTAAGCCCATCG-3 ' ; queratina 14, adelante 5'-GGACGCCCACCTTTCATCTTC 3 ' y revertir 5'-ATCTGGCGGTTGGTG GAGG-3 ' ; GAPDH, adelante 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' y revertir 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ' ; BMP4, adelante 5'-AGCAGCCAAACTATGGGCTA-3 ' y revertir 5'-TGGTTGAGTTGAGGTGGTCA-3 ' ; BMP6, adelante 5'-AACCAACCACGCGATTGTG-5 ' y revertir 5'-AAGTCTCATCGTCCCACCTC-3 ' , y ALP, adelante 5'-CAAACCGAGATACAAGCACTCCC-3 ' y revertir 5'-CGAAGAGACCCAATAGGTAGTCCAC-3 ' .
Figura 1. Efectos de VPA y MNX en el nuevo crecimiento, etapa del ciclo del pelo del pelo en la piel del ratón.
La piel de la espalda, de 7 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó y se trata a diario con la aplicación tópica de vehículo, 500 mM de ácido valproico (VPA) o minoxidil 100 mM (MNX) durante 28 d. (A) las imágenes brutas que muestran el crecimiento de cabello en ratones C3H tratados con VPA o MNX durante 28 d (panel superior) y la tinción H & E de la piel tratada con MNX VPA o durante 28 d (panel inferior). (B) analiza histomorphometic cuantitativa de los tejidos de la piel tratadas con VPA o MNX de 28 d se realizaron con 5 ratones de cada grupo; anagen temprano, anagen I-anagen II; anagen Media, anagen III-IV; Late anágena, anágena V anágeno VI; catagen Temprana, catagen I-catagen III; catagen Media, catagen IV-V; Late catágeno catagen VI-VIII catagen. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre los grupos control y de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001. Ampliación original: A, × 100 (H & E tinción).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g001
Figura 2. Efectos de VPA y MNX sobre marcadores de diferenciación epidérmica, actividades de ALP y marcadores de células madre foliculares de pelo.
La piel de la espalda, de 7 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó y se trata a diario con la aplicación tópica de vehículo, 500 mM de ácido valproico (VPA) o minoxidil 100 mM (MNX) durante 7 días o 28 d. (A) El análisis inmunohistoquímico de la epidermis de ratones C3H tratados con VPA o MNX durante 28 d con un anticuerpo contra β-catenina, filagrina, loricrina, queratina 14, p-Erk, p-Akt, o PCNA. (B) El análisis inmunohistoquímico de la expresión de β-catenina en los folículos pilosos (panel superior) y la tinción de ALP (panel inferior) del tratado con vehículo, VPA, o MNX durante 7 días la piel. Región azul oscuro en las papilas dérmicas de los folículos pilosos (una flecha roja en el panel del medio) representan positividad para la actividad ALP. (C) El análisis inmunohistoquímico se realizó con anti-queratina 15, o-CD34 anticuerpo. Ampliación original: A, × 635; B, × 635 (inmunohistoquímica) y × 400 (tinción ALP); C, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g002
Figura 3. Efectos de VPA y MNX sobre el estado de activación de la / β-catenina vía Wnt y la actividad de ALP en las células de la papila dérmica humanos.
Células de la papila dérmica Humanos en el paso 11 con una mínima actividad ALP se utilizaron para probar la capacidad de VPA y MNX para recuperar la actividad de ALP. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, G418 (100 mg / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y la penicilina G sódica (100 mg / ml) en 5% de CO 2 a 37 ° C, y tratados con VPA 1 mM o 100 mM MNX para 72 h. (A) Western blot para β-catenina, BMP4, ALP y α-tubulina. (B) La tinción inmunocitoquímica con anticuerpos contra la β-catenina o BMP4. (C) ALP tinción. La morfología celular (paneles de la izquierda) se examinó bajo un microscopio de campo claro. La tinción con azul oscuro indica células ALP-expresión (paneles de la derecha). (D) de Western blot para β-catenina, BMP4, ALP, y α-tubulina en las células de la papila dérmica humanos tratados con VPA o noggin (500 ng / ml). (E) de Western blot para β-catenina, BMP4, ALP, y la expresión de α-tubulina en las células de la papila dérmica humanos tratados con Wnt3a (200 o 40 ng / ml), BMP4 (100 o 20 ng / ml), o EGF (100 o 20 ng / ml) durante 72 h. (C) actividad de la ALP se midió como se describe en Métodos después del tratamiento con Wnt3a (200 ng / ml), BMP4 (100 ng / ml), o EGF (100 ng / ml) durante 72 h. Los asteriscos indican diferencias significativas entre el control y el grupo de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05 y dos asteriscos siendo p <0,005. Ampliación original: B, × 635; C, × 100.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g003
Figura 4. Efectos de la Wnt / β-catenina activadores de la vía sobre el crecimiento de cabello en la piel del ratón.
El vehículo, VPA 500 mM, MNX 100 o derivados de VPA (PBA 500 mM, EBA 500 mM) se aplica tópicamente a lomo afeitado de la piel de los ratones C3H al día durante 28 d. (A) las imágenes brutas de re-crecimiento del cabello (primer panel de fila), inmunohistoquímica de la piel tratada con la droga con un anticuerpo contra β-catenina (segundo panel de fila), y la tinción H & E de la piel tratada con las drogas (panel tercera fila). (B) Se realizaron análisis histomorfométricos Cuantitativos para 5 ratones de cada grupo. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre el control y el grupo de prueba, medida por la prueba t con una asteriscos siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001. Ampliación original: A, × 100 (tinción H & E) y × 635 (inmunohistoquímica).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g004
Figura 5. Efectos de la Wnt / β-catenina activadores de la vía en la regulación de BMP y la actividad de la fosfatasa alcalina.
Células de la papila dérmica Humanos en el paso 11 con una mínima actividad ALP se utilizaron para probar la capacidad de recuperar la actividad de ALP. (A) Morfología (paneles superiores) y los patrones de tinción de fosfatasa alcalina (paneles inferiores) de células de la papila dérmica humanos tratados con VPA 1 mM, 1 mM de PBA, 1 mM de EBA. Las células se observaron bajo campo claro. (B) transferencia de Western para β-catenina, ALP, o la expresión de α-tubulina en los extractos preparados a partir de células de papila dérmica humana tratados con el fármaco. (C) Análisis de RT-PCR de BMP4, BMP6, ALP, y la expresión de GAPDH utilizando ARN total preparado a partir de células de papila dérmica humana tratados con el fármaco. (D) actividad de ALP. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre el control y el grupo de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005. Ampliación original: B, × 100.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g005
Figura 6. Efectos de VPA o MNX sobre el crecimiento del cabello inducida por lesión.
Cuatro escisiones de grosor completo (0,2 cm 2 heridas circulares) de la piel se hicieron sobre las espaldas de C3H 8 semanas de edad o TOP-Gal ratones transgénicos, y VPA 500 mM mM o MNX 100 se aplican por vía tópica diaria a las heridas. (A) las imágenes brutas de representante heridos espalda piel de ratones C3H 25 d después de la aplicación del fármaco. (B) tinción H & E de la piel herida tratados con VPA o MNX. (C, D) de transferencia Western (C) e inmunohistoquímicos (D) análisis de β-catenina, filagrina, loricrina y la queratina 14 en las heridas. Pieles (E) heridos fueron tratados con vehículo, VPA, o MNX por 14 días, y el tejido se sometieron a ensayos de tinción de fosfatasa alcalina. Análisis (F) inmunohistoquímica se realizó con anti-queratina 15, o-CD34 anticuerpo. Ampliación original: B, × 200; C, × 635; D, × 200, E, × 200, F, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g006
La inmunohistoquímica
Tejidos de la piel se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4%. Secciones de parafina (4 m de espesor) se deparaffinized y rehidratada. Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se trataron en autoclave en mM tampón de citrato de sodio 10. Las secciones se pre-incubaron en PBS y después se bloquearon en PBS que contenía 5% de albúmina de suero bovino y 1% de suero de cabra a temperatura ambiente durante 30 min. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: anti-β-catenina (BD transducción de laboratorio, 1:100), p-Erk (Cell Signaling, 1:30), p-Akt (Santa Cruz , 01:50),,, (sistemas de PCNA (Santa Cruz, 1:500) filagrina (Covance, 1:500), loricrina (Covance, 1:500), queratina 14 (Covance, 1:500) BMP4 de I + D, 1 : 50), la queratina 15 (Thermo Scientific, CA, 1:200), CD34 (Abcam, 1:30), nestin (BD Bioscience, 1:200), Ki67 (Abcam, 1:500), y la queratina 17 (Abcam , 1:100). Las secciones fueron lavadas con PBS y se incubaron con Alexa Fluor 488 - o Alexa Fluor 555-anticuerpo secundario conjugado de IgG (Molecular Probes, 1:400) a temperatura ambiente durante 1 h y a contratinción con DAPI (4 ',6-diamino-2- fenilindol, Boehringer Mannheim, 1:5000). Las señales fluorescentes se visualizaron en un microscopio confocal LSM510 META (Carl Zeiss).
La tinción de fosfatasa alcalina
Células de la papila dérmica Humanos se sembraron en placas de 12 pocillos a 7,5 × 10 4 células por pocillo. Después del crecimiento durante 24 h, las células se trataron con fármacos durante 72 h, y después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min y se lavaron con PBS. Para la tinción óptima, las células se enjuagaron en tampón TN (0,1 M de Tris-HCl, NaCl 0,1 M, pH 9,5). Las células se incubaron en 120 tetrazolio g / ml 4-nitroazul y 60 mg / ml de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolylphophate) en tampón TN durante 30 min. La reacción se detuvo mediante lavado con PBS, y las células se examinaron bajo un microscopio de campo brillante. La tinción con azul oscuro indica señal positiva para ALP. Para la tinción de ALP de los tejidos, criosecciones 10-M se incubaron con BCIP y se analizaron como anteriormente. Actividad de la ALP se midió a 405 nm por FLUOstar OPTIMA luminómetro.
X-gal tinción de tejidos
Tejido de la piel fresca se fijó en 4% paraformaldehido durante la noche y luego incorporados en el tejido compuesto Tek octubre (Sakura Finetechnical). Criosecciones (10-M) se prepararon en portaobjetos recubiertos y utilizados para X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactop yranoside, Oro Biotecnología) tinción. Las secciones se fijaron con 0,2% glutaraldehído durante 5 min, se lavaron con PBS durante 5 min, y se incubaron en una solución 1 mg / ml de X-gal durante 24 h a temperatura ambiente en un ambiente húmedo. Los portaobjetos se lavaron durante 5 min con PBS, se enjuagaron con agua destilada, y se contratiñeron con Nuclear Fast Red durante 5 min.
Resultados
Ácido valproico promueve el crecimiento de cabello e induce diferenciación terminal Marcadores Cabello en Vivo
Pusimos a prueba la actividad de crecimiento de cabello de LiCl y VPA, dos activadores químicos de la Wnt / β-catenina vía [25] , [26] . VPA o LiCl se aplicó por vía tópica diaria sobre las espaldas de ratones C3H a diferentes concentraciones para determinar la concentración óptima para cada agente. MNX se aplicó por separado como un control positivo. Los ratones tratados con 1 M de LiCl o VPA 500 mM mostraron fenotipos de crecimiento del cabello ( Figuras S1A y S1B ). Especialmente, VPA promovió el crecimiento de cabello tan eficientemente como MNX después de 28 d ( Figura 1A ). Los folículos pilosos de los ratones tratados con VPA o MNX entraron en la fase anágena, mientras que los folículos pilosos en el grupo de control tratado con solución de vehículo se mantuvieron en fase telógena ( Figura 1A , los datos para diferentes tiempos de tratamiento de drogas se muestran en la Figura S2 ). Los análisis histomorfométricos demostraron que el VPA promovió telógeno-anágena transición ( Figura 1B ). Especialmente, los folículos del pelo de los ratones tratados con VPA fueron transformados a media o tardía-anágena ( Figura 1B ). El análisis inmunohistoquímico confirmó que la expresión de la filagrina y loricrina se incrementó en un VPA o MNX ( Figura 2A , los datos para los diferentes tiempos de tratamiento de drogas se muestra en las figuras S2B y S2C ). No se observó ningún fenotipos anormales significativos en la epidermis, folículos pilosos, u otras estructuras de la piel aparte de nuevo crecimiento del pelo después de la aplicación de VPA o MNX ( Figura 1A ). En contraste con la epidermis de la piel del ratón tratados con VPA, la piel que se trató con LiCl reveló cambios anormales críticos incluyendo un aumento en el espesor de la epidermis ( Figura S3 ), donde la expresión de la filagrina, loricrina, y la queratina 14 también era anormalmente elevado como se muestra mediante inmunohistoquímica ( Figura S3 ).
Ácido valproico Activa la Wnt / β-catenina vía en adición a las Erk y Akt Pathways
La expresión de β-catenina en la piel de ratones se incrementó significativamente por la aplicación de VPA, pero sólo ligeramente aumentado en MNX ( Figura 2A ). MNX es conocido por promover el crecimiento de cabello a través de las vías de Erk y Akt, que están implicados en la regulación de la proliferación de células de la papila dérmica del folículo piloso [27] . Curiosamente, las actividades tanto de Erk y Akt se mejoraron de manera similar por tratamiento con VPA o MNX ( Figura 2A ). El nivel de expresión del PCNA marcador de proliferación se incrementó mediante la aplicación de VPA o MNX comparación con el control de la piel ( Figura 2A ). Por lo tanto, el VPA hasta regula el / vía de β-catenina Wnt en Además de las vías de Erk y Akt, pero a través de un mecanismo diferente.
Para examinar los efectos a corto plazo de VPA en el crecimiento de cabello, se analizó la piel de ratones C3H después de la aplicación de VPA o MNX durante 7 d. El espesor de la epidermis y aumentó ligeramente el número de folículos pilosos aumentó 7 d después de la aplicación de VPA o MNX ( Figura S4A , panel superior). El análisis inmunohistoquímico mostró que la expresión keratin14 se incrementó después de una aplicación de 7 d de VPA o MNX ( Figura S4A , panel inferior), aunque el nivel de keratin14 no se ha modificado 28 d aplicación de VPA o MNX ( Figura 2A ). Curiosamente, VPA, pero no MNX, aumentó en gran medida la expresión de β-catenina en los folículos pilosos de ratones C3H ( Figura 2B ). También se observó una inducción significativa de ALP en la papila dérmica después de la aplicación de VPA, pero no MNX ( Figuras 2B y S 4B). Por otra parte, se confirmó la activación específica de la / β-catenina vía Wnt en las regiones de la corteza pre- [4] de la piel de ratones reportero TOP-Gal Wnt tratados durante 7 días con VPA, pero no MNX ( Figura S4C ). Curiosamente, la queratina 15 y CD34, los marcadores de células madre foliculares de pelo, fueron inducidos en las células bombeo mediante la aplicación de VPA durante 7 d ( Figura 2C ), pero no por la aplicación de la MSX.
Ácido valproico, pero no MNX, hasta regula la Wnt / β-catenina y ALP actividad en las células humanas papila dérmica
Para identificar si el VPA puede activar el / vía de β-catenina Wnt en sistemas humanos, se utilizó un in vitro sistema de cultivo de células de la papila dérmica humanos. El nivel de expresión de β-catenina se incrementó en gran medida por el tratamiento con VPA, pero no MNX durante 72 h ( Figuras 3A y S 5). Del mismo modo, la expresión tanto de BMP4 y ALP se aumentó por VPA, pero no MNX ( Figuras 3A y S 5). También confirmó la activación significativa de β-catenina y BMP4 en células de la papila dérmica humanos tratados con VPA por inmunocitoquímica, y otra vez que no se observó esos cambios después del tratamiento con MNX ( Figura 3B ). Para evaluar el efecto de VPA o MNX sobre la regulación de la actividad de ALP, hemos utilizado células de la papila dérmica humanos en el paso 11 que mostraron muy débil actividad de la ALP. Se observó un aumento significativo en la actividad de ALP después del tratamiento con VPA, pero no MNX ( Figura 3C ). Por otra parte, la inducción de la actividad de ALP por VPA fue bloqueado por Noggin, un antagonista de BMP4 ( Figura 3D ). Para confirmar el papel de la / vía de β-catenina Wnt en la activación de ALP, que mide los efectos de Wnt3a, BMP4, o factor de crecimiento epidérmico (EGF) ligando en ALP. La expresión de ambas ALP y β-catenina se incrementó significativamente por el tratamiento con Wnt3a o BMP4 de una manera dependiente de la concentración, mientras que estos cambios no fueron inducidos de manera significativa mediante el tratamiento con EGF ( Figura 3E ). La activación específica de ALP por Wnt3a y BMP también se confirmó mediante un ensayo enzimático directo ( Figura 3F ).
Los activadores de la vía Wnt / β-catenina promover el crecimiento de cabello en Vivo
Para confirmar el papel del / β-catenina vía Wnt en el crecimiento de cabello, hemos probado los efectos de los fármacos que regulan el / β-catenina vía Wnt en el pelo vuelva a crecer en ratones. Cloruro de berilio (BeCl 2 ), LiCl (un inhibidor de GSK3 alternativa), y varios derivados de VPA incluyendo el ácido 4-fenil butírico (PBA) y ácido butírico 2-etil (EBA) fueron probados por sus efectos sobre el crecimiento de cabello. PBA o EBA inducen el crecimiento de cabello después de la aplicación tópica en la parte posterior de los ratones C3H de 28 d ( Figura 4 A , primer panel de la fila). Los niveles de β-catenina se incrementaron mediante el tratamiento con PBA, pero no EBA ( Figura 4A , panel de segunda fila). Los folículos pilosos de tejidos de la piel tratados con PBA o EBA entraron en la fase anágena, como se muestra por tinción H & E ( Figura 4A , panel de tercera fila). Análisis histomorfométrico reveló que la PBA y EBA también indujeron transición telógeno anágena ( Figura 4B ). LiCl o BeCl 2 también induce el crecimiento de cabello después de 35 días a pesar de su creciente actividad pelo era suave ( Figura S6A , primer panel de la fila). El tratamiento con LiCl o BeCl 2 aumenta los niveles de β-catenina y ciclo del cabello acelerada en la fase anágena ( Figura S6A , segundo panel de la fila y el panel de tercera fila). Sin embargo, el espesor de la epidermis se aumentó en la piel tratada con BeCl 2 o PBA comparación con el control de la piel, como se describió anteriormente para la aplicación de LiCl. La expresión de la filagrina y la loricrina se incrementó anormalmente por aplicación de BeCl 2 , similar al efecto de LiCl ( Figura S6B ). Sin embargo, las actividades de Erk y Akt se incrementaron en un tratamiento con todos los medicamentos, incluyendo EBA ( Figuras S6C y S7 ).
Actividad de la ALP se aumentó por el tratamiento con VPA o PBA, que también regulado hasta el / β-catenina vía Wnt en la papila dérmica humana ( Figura 5A ). Curiosamente, el tratamiento con EBA, que no afecta a la / β-catenina vía Wnt, no aumentó significativamente la actividad de ALP ( Figura 5A ). Además, se aumentaron los niveles de proteína y de ARNm de ALP después del tratamiento con VPA o PBA, que también aumentó el nivel de proteína de β-catenina, pero no por el tratamiento con MNX o EBA ( Figuras 5B, 5C, y S
. Expresión de ARNm de BMP4 se aumentó por el tratamiento con VPA, pero sólo se incrementó marginalmente por tratamiento con MNX o PBA y no se indujo en absoluto por la ABE. Expresión de BMP6, que induce los efectos más pronunciados sobre la activación de ALP entre las BMPs [28] , se incrementó notablemente por cualquiera de VPA o PBA pero no por MNX o EBA ( Figura 5C ). La activación específica de ALP por VPA o PBA también se confirmó mediante un ensayo enzimático directo ( Figura 5D ). El modelo de ratón mostró fenotipos similares a los observados en las células de la papila dérmica humanos; los niveles de β-catenina en la epidermis y la ALP en papilas dérmicas se incrementaron de manera significativa mediante la aplicación de VPA o PBA durante 7 d, pero no se cambiaron por aplicación de MNX o EBA ( Figuras S9A y S9B ).
Ácido valproico promueve el crecimiento del pelo en heridas cutáneas en ratones
La activación de la / vía de β-catenina Wnt en queratinocitos epidérmicos potencialmente puede inducir el crecimiento del pelo en la piel del ratón que está dañado por hiriendo [29] . Para probar la eficacia de VPA en el crecimiento del cabello inducida por lesión, se aplicó diariamente VPA a la zona de la herida (diámetro = 0,5 mm) de ratones C3H. Áreas La presencia de células madre epiteliales en los folículos pilosos alrededor de la herida induce ciclismo pelo espontánea como se informó anteriormente [30] , y VPA mejorado aún más significativamente el crecimiento del cabello ( Figuras 6A y S 10A) y la transición de la fase telógena a la fase anágena en el sitio de la herida según lo revelado por el análisis histológico ( Figura 6B ). Los niveles de expresión de fillaggrin, loricrina, y la queratina 14 en las heridas también se incrementó en concreto mediante la aplicación de VPA durante 14 días tanto por inmunoblot y análisis inmunohistoquímicos ( Figuras 6C y 6D ). Por otra parte, el VPA activa específicamente la vía Wnt / β-catenina durante el crecimiento del pelo en los sitios de la herida, como se muestra por el aumento de la expresión de β-catenina ( Figuras 6C y 6D ) y la inducción de β-galactosidasa en los folículos pilosos recién formadas de reportero TOP-Gal Wnt los ratones ( Figura S10B ; ratones representativos hairg fenotipos de crecimiento por aplicación de la droga se muestran en la Figura S10C ). Es importante destacar que también se observó un aumento en la actividad de la ALP en los folículos del pelo después de la aplicación de VPA ( Figura 6E ). La queratina 15 y CD34, los marcadores de células madre foliculares del pelo, se incrementaron después de 25 días de aplicación de VPA a las heridas ( Figura 6F ).
Discusión
VPA es un fármaco antiepiléptico con frecuencia prescrita por su seguridad y eficacia [10] , [11] . El uso prolongado de VPA dio lugar a varios efectos secundarios como la pérdida de cabello por la ingesta oral; estos efectos adversos se atribuyen al zinc y al agotamiento de biotinidasa [31] . No se observaron efectos de re-crecimiento del cabello cuando VPA se administró oralmente a ratones C57BL / 6 ( Figuras S11a y S11b ). Sin embargo, la aplicación tópica de VPA promovió significativamente la formación de cabello en modelos murinos. Los niveles de β-catenina en la piel de ratones se aumentaron específicamente por aplicación tópica de VPA ( Figura S11C ).
En este estudio, hemos demostrado que los inhibidores de GSK3 que activan la Wnt / β-catenina vía [17] , [18] , [25] , [32] podrían potencialmente desarrollarse como fármacos para tratar la pérdida del cabello y la calvicie que implica defectos en los folículos pilosos . Entre éstos, el VPA fue identificado como el factor de re-crecimiento del cabello más potente sin causar anormalidades de la piel en ratones. Inhibidores alternativos de GSK3, LiCl o BeCl 2 , también estimularon el crecimiento de cabello y regresaron el ciclo del pelo a la fase anágena, pero aumentaron de forma anormal el espesor de la epidermis con hiper-activación de marcadores epidérmicas terminales diferenciadas. En contraste con la epidermis de la piel de ratón tratado con otro inhibidor de GSK3, la piel de los ratones C3H tratados con VPA no puso de manifiesto ninguna fenotipos anormales significativos en la epidermis. Encontramos que la fosfatasa alcalina es un marcador altamente creíble para la activación de la / β-catenina vía Wnt, y la importancia de la / β-catenina vía Wnt en la activación de ALP fue confirmada por la demostración de que la ALP no estaba regulado por la MSX o EBA, que no inducir la expresión de β-catenina y BMP4. Se sabe que el VPA estimula la diferenciación neuronal de células progenitoras neurales a través de la inducción de BMP4 [33] , [34] , y el efecto de BMP4 en la actividad inductor de cabello también se informó anteriormente [28] . Nuestro estudio se informa de que BMP4 juega un papel como un activador de la ALP confirma una vez más la importancia de la / β-catenina vía Wnt en el crecimiento de cabello.
Aunque el efecto relativo fue pequeño en comparación con VPA o PBA, EBA (que no se activó β-catenina y BMP4 o ALP), siendo inducido la formación del pelo. Estos resultados indican que la actividad inductora de pelo de la EBA puede ser independiente de la / β-catenina vía Wnt, y de hecho nos confirmaron que la ABE activación de Erk y Akt, que a su vez participa en la proliferación de queratinocitos inducida. Curiosamente, VPA expresión inducida de los marcadores de células madre foliculares del pelo ketatin 15 y CD34 durante la formación del cabello y el crecimiento inducido por la herida. VPA se sabe que inducen la expresión de CD34 y mejorar stemness [35] , [36] . Los cueros cabelludos calvas de los hombres con alopecia androgenética carecen de CD200-ricos, células progenitoras del folículo piloso CD34-positivo, y tienen un defecto en la conversión de las células madre del folículo piloso a las células progenitoras, que desempeñan un papel en la patogénesis de la alopecia androgenética [37]. Los resultados de nuestro estudio indican que las pequeñas moléculas que activan el / β-catenina vía Wnt, como VPA, potencialmente pueden ser aplicados para el desarrollo de drogas para acelerar el ciclo del cabello y estimular el crecimiento de cabello.
Información de Apoyo
Pelo vuelva a crecer después de la aplicación tópica de LiCl, VPA, o MNX a la piel de ratones. Volver piel de 8 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó, vehículo o varias concentraciones de LiCl, VPA, o MNX se aplicaron tópicamente durante 35 d . (A) Imágenes manifiestas de los ratones tratados con LiCl, VPA, o MNX. (B) las imágenes ampliadas de la piel representante de Figura S1 .
Figura S1.
Pelo vuelva a crecer después de la aplicación tópica de LiCl, VPA, o MNX a la piel de ratones. Volver piel de 8 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó, vehículo o varias concentraciones de LiCl, VPA, o MNX se aplicaron tópicamente durante 35 d . (A) Imágenes manifiestas de los ratones tratados con LiCl, VPA, o MNX. (B) las imágenes ampliadas de la piel representante de Figura S1 .
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s001
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Figura S2.
Efectos de VPA o MNX en β-catenina, la diferenciación epidérmica, y marcadores de proliferación en la piel del ratón. ratones C3H fueron tratados con VPA o MNX de 7, 14, o 21 d. Tinción de H & E y los análisis inmunohistoquímicos se realizaron como se describe en la Figura 1 y 2 . Ampliación original: H & E, x 200; inmunohistoquímica, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s002
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Figura S3.
Efectos de LiCl en marcadores de diferenciación epidérmica, β-catenina, PCNA y actividades de Erk y Akt en la piel del ratón. tejido de la piel tratada con LiCl se escindió y se sometieron a tinción H & E, la tinción de ALP, o el análisis inmunohistoquímico para la detección de la filagrina, loricrina, keratin14 , β-catenina, p-Erk, p-Akt, y PCNA como se describe en las Figuras 1 y 2 . Ampliación original: H & E, × 100; inmunohistoquímica, × 635; tinción ALP, × 200.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s003
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Figura S4.
Efectos de VPA o MNX sobre la expresión de keratin14, ALP o β-galactosidasa actividades de vigilancia de las actividades de Wnt / β-catenina en ratones piel. ratones C3H fueron tratados con VPA o MNX durante 7 d. (A) tinción H & E (panel superior) y el análisis de inmunohistoquímica para queratina 14 (panel inferior) en la piel tratada. (B) tinción ALP de control, VPA-o de la piel de ratones tratados con la MSX. (C) TOP-GAL tejidos ratones transgénicos tratados con vehículo, VPA, o MNX durante 7 días fueron sometidos a la tinción con X-gal para examinar la regulación de la / β-catenina vía Wnt. Región azul de los folículos pilosos de IMDb para la señalización de Wnt / β-catenina positivo. Ampliación original: A, × 100; B, × 200; C, × 400 (panel izquierdo) y × 200 (panel derecho).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s004
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Figura S5.
Efectos de VPA y MNX sobre el estado de activación de la / β-catenina vía de Wnt y ALP en células de la papila dérmica humanos. células de la papila dérmica humanos se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor y fueron tratados con VPA 1 mM o 100 M MNX durante 72 h. Western Blot se realizó en células de la papila dérmica humanos tratados con VPA o MNX. La expresión relativa de cada proteína, tal como β-catenina, BMP4, y ALP se calculó como la relación de cada nivel de expresión de la proteína a nivel de α-tubulina. El software utilizado para la cuantificación fue multi-Gauge V 3.0 (Fujifilm). Los asteriscos denotan diferencias significativas entre los grupos control y de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s005
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Figura S6.
Efectos de la Wnt / β-catenina activadores de la vía sobre el crecimiento de cabello en la piel del ratón. La piel de la espalda de los ratones C3H se afeitó y se trata con la aplicación tópica de vehículo, inhibidor de GSK3 alternativa (1 M LiCl, mM BeCl 200 2 ) al día durante 35 d. (A) las imágenes brutas de re-crecimiento (primer panel fila) el pelo, la inmunohistoquímica de LiCl o BeCl 2 piel tratada con anticuerpo contra β-catenina (segundo panel de fila), y la tinción H & E de LiCl o BeCl 2 piel tratada (tercera panel de fila). (B) El análisis inmunohistoquímico de la filagrina, loricrina y keratin14 en LiCl o BeCl 2 piel tratada. (C) El análisis inmunohistoquímico de p-Erk y p-Akt en LiCl o BeCl 2 piel tratada. Ampliación original: A, × 100 (tinción H & E) y × 400 (inmunohistoquímica), B, × 635; C, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s006
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Figura S7.
Efectos de VPA, MNX y derivados de VPA en marcadores de diferenciación epidérmica en la piel del ratón. La piel de la espalda de los ratones C3H se afeitó y tratado con una aplicación tópica del vehículo, VPA 500 mM, 100 mM MNX, o derivados de VPA (PBA 500 mM , 500 mM EBA) al día durante 28 d. El análisis inmunohistoquímico de la filagrina, loricrina, keratin14, β-catenina, p-Erk, p-Akt, y PCNA en la piel tratada con las drogas. Ampliación original: × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s007
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Figura S8.
Efectos de Wnt / β-catenina activadores de la vía en el estado de activación de la / β-catenina vía de Wnt y ALP en células de la papila dérmica humanos. células de la papila dérmicos humanos fueron tratadas con VPA 1 mM, 100 mM MNX, 1 mM de PBA, o 1 EBA mM durante 72 h. La expresión relativa de β-catenina o ALP se calculó como la relación de cada nivel de la proteína a nivel de α-tubulina. El software utilizado para la cuantificación fue multi-Gauge V 3.0 (Fujifilm). Los asteriscos indican las diferencias significativas entre los grupos control y de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s008
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Figura S9.
Efectos de VPA, MNX, PBA, y EBA en la activación de Wnt / vía de β-catenina, la actividad de ALP in vivo. Después de la aplicación tópica de VPA 500 mM, 100 mM MNX, PBA 500 mM, o EBA 500 mm sobre las espaldas de los ratones C3H de 7 d, el tejido de la piel se ha escindido del área tratada para inmunohistoquímica y tinción ALP. (A) La tinción inmunohistoquímica para β-catenina o queratina 14. (B) El análisis inmunohistoquímico de β-catenina (panel superior) y la tinción de ALP (panel inferior) de los folículos pilosos de tratados con vehículo, VPA, MNX, PBA, o EBA piel. Regiones de color azul oscuro en la papila dérmica de los folículos pilosos (flechas rojas) representan la tinción positiva para la actividad ALP. Ampliación original: A, × 635; B, × 635 (inmunohistoquímica) y × 400 (tinción ALP).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s009
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Figura S10.
Efectos de VPA y MNX sobre el crecimiento del cabello inducida por lesión y la activación de la / β-catenina señalización Wnt in vivo . Cuatro escisiones de piel de espesor (0,2 cm 2 heridas circulares) se hicieron sobre las espaldas de ratones C3H 8 semanas de edad , y VPA mM o 500 mM de MNX 100 se aplicó por vía tópica diaria. (A) Imágenes manifiestas de la piel herida dorso de ratones C3H 25 d después de la aplicación de la droga. Paneles de la derecha están ampliadas de imágenes representativas. (B) pieles heridos en ratones transgénicos TOP-GAL fueron tratados con vehículo, VPA, o MNX de 14 d, y el tejido se sometió a tinción con X-gal. (C) las imágenes brutas de la piel herida dorso de ratones TOP-gal 14 d después de la aplicación de los medicamentos. Ampliación original: B, × 200.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s010
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Figura S11.
Efectos de VPA o MNX por administración oral en el crecimiento de cabello. (A) Imágenes manifiestas de C57BL / 6 ratones por vía oral administrados por VPA o MNX. La piel de la espalda de ratones C57BL / 6 se afeitó y VPA o MNX se administró por vía oral a una dosis de 200 mg / kg para el 35 d. (B) Tinción H & E de la piel de ratones se administró oralmente o por vía tópica aplicada por VPA. VPA se administró por vía oral a una dosis de 200 mg / kg o por vía tópica aplicada a 500 mM durante 35 d. (C) El análisis inmunohistoquímico de β-catenina, filaggirn, loricrina y keratin14 piel en ratones por vía oral o tópica aplicada por VPA. Ampliación original: B, × 100; C, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s011
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Abstracto
Fondo
La alopecia es la pérdida del cabello problema común que puede afectar a muchas personas. Sin embargo, las terapias actuales para el tratamiento de la alopecia están limitados por la baja eficacia y los efectos secundarios potencialmente indeseables. Hemos identificado una nueva función para el ácido valproico (VPA), un inhibidor de GSK3 que activa el / β-catenina vía Wnt, para promover el crecimiento de cabello in vitro e in vivo .
Metodología / Principales conclusiones
La aplicación tópica de VPA a ratones C3H varones estimulado críticamente el crecimiento de cabello e indujo marcadores epidérmicas terminales diferenciadas como filagrina y loricrina, y la fosfatasa papila dérmica marcador alcalina (ALP). VPA indujo ALP en las células de la papila dérmica humanos hasta la regulación de la / β-catenina vía Wnt, mientras que el minoxidil (MNX), un fármaco comúnmente utilizado para tratar la alopecia, no afectó significativamente el / β-catenina vía Wnt. Análogos de VPA y otros inhibidores de GSK3 que activan el / β-catenina vía Wnt, como el ácido 4-fenil butírico, LiCl, y BeCl 2 actividades que promueven el crecimiento del pelo también exhibidos en vivo . Es importante destacar que, VPA, pero no MNX, estimular con éxito el crecimiento del vello en las heridas de los ratones C3H.
Conclusiones / Importancia
Nuestros resultados indican que las pequeñas moléculas que activan el / β-catenina vía Wnt, como VPA, potencialmente se pueden desarrollar como fármacos para estimular el crecimiento de cabello.
Cifras
Introducción
La alopecia provoca graves problemas a muchas personas en el mundo. Sin embargo, las terapias actuales para el tratamiento de la alopecia están limitados por la baja eficacia y los efectos secundarios potencialmente indeseables causados por la aplicación de los fármacos disponibles [1] . El / β-catenina vía de Wnt es importante para varios procesos de desarrollo, incluyendo el desarrollo del folículo piloso [2] - [4] . La activación es necesaria de la / vía de β-catenina vía para la iniciación de la formación de folículo piloso [5] , y estimula el crecimiento y la diferenciación del pelo por mantenimiento de la expresión de genes que funcionan en la fase anágena del ciclo del pelo [6] . Wnt3a y Wnt7a mantienen papilas dérmicas en la fase anágena como señales inductivas para el crecimiento del cabello [6] . Además, β-catenina se acumula en los núcleos de las papilas dérmicas, durante la fase anágena, y proporciona señales de crecimiento para células progenitoras del folículo piloso [7] , [8] . Finalmente, el / β-catenina vía de Wnt desempeña un papel en la diferenciación de células madre en los queratinocitos foliculares del cabello [9] . Juntos, estos hallazgos indican que el / vía de β-catenina Wnt podría ser una diana ideal para el desarrollo de fármacos que activan el crecimiento del cabello mediante la inducción de genes de fase anágena. Por desgracia, actualmente no hay medicamentos que se sabe que estimulan el crecimiento del cabello apuntando el / β-catenina vía Wnt.
El ácido valproico (VPA, ácido 2-propil-pentanoico) es un estabilizador del ánimo comúnmente prescrito para el tratamiento de la epilepsia y el trastorno bipolar en los últimos decenios [10] , [11] . VPA es conocido como un inhibidor de histona desacetilasa que ejerce sus efectos a través de la modificación de la estructura de la cromatina y la expresión de genes [12] , [13] . VPA también se sabe que afecta a varias vías de señalización diferentes, incluyendo la proteína quinasa C, la señal extracelular-quinasa regulada (ERK), y Wnt / β-catenina vías [14] - [16] . VPA activa el / vía β-catenina vía mediante la inhibición de GSK3 [17] , [18] , lo que conduce a la remodelación axonal, la agrupación de proteína sináptica, y la diferenciación de células progenitoras neuronales [19] , [20] .
Se investigó el efecto de VPA en el nuevo crecimiento del pelo de los ratones C3H considerando la relación entre el / β-catenina vía Wnt y la formación de cabello. VPA induce el crecimiento de cabello tan eficientemente como MNX y activó el / β-catenina vía Wnt in vivo . La importancia potencial de VPA en la re-crecimiento del cabello humano se indicó por el aumento de la expresión de ALP y la activación de la vía Wnt / β-catenina tras el tratamiento de VPA en células de la papila dérmica humanos. La fosfatasa alcalina (ALP), un prominente marcador de papila dérmica [21] - [23] , fue identificado como un marcador crítico para la promoción del crecimiento del pelo. El papel del / β-catenina vía Wnt en la regulación de la actividad de ALP se procedió a investigar mediante pruebas de análogos de VPA y otros activadores Wnt in vivo e in vitro . Por último, se caracterizaron más funciones específicas de VPA en el crecimiento del cabello inducida en las heridas de los ratones C3H. Estos efectos de VPA que acompañan a la activación de la queratina 15 y CD34 marcadores de células madre también se correlacionan con la / β-catenina vía de Wnt y actividades de ALP.
Materiales y Métodos
Reactivos
VPA, 4-fenil butírico (PBA), y ácido butírico 2-etil (EBA) se adquirieron de Acros. El cloruro de litio (LiCl) y cloruro de berilio (BeCl 2 ) fueron adquiridos de Sigma, y MNX se adquirió de Daejung.
Animales y en Vivo Ensayo de Crecimiento del Cabello
Seis semanas de edad ratones C3H masculinos fueron adquiridos de Orient Bio Co., y se les permite adaptarse a su nuevo ambiente durante 1 semana. Los pelos de la espalda de ratones 7 semanas de edad, cuyo cabello folículos se encontraban en fase de telógeno, se afeitó con una cortadora de cabello y 300 l de cada fármaco a una concentración apropiada (como se describe en leyendas de las figuras) se aplicó tópicamente al día hasta a 28 d. Todos los reactivos utilizados en el ensayo de re-crecimiento del cabello se disolvieron en un vehículo compuesto por 50% (vol / vol) de etanol, 30% de agua, y 20% de glicol de propileno. TOP-GAL ratones transgénicos que llevan el lac Z gen reportero de aguas abajo de la de c-fos promotor que responde a la potenciador linfoide factor de unión 1/transcription factor de 3 (LEF / TCF) vía de señalización mediada y activado β-catenina se adquirieron en el Jackson Laboratory . La genotipificación se confirmó por reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR) utilizando los siguientes cebadores: transgén hacia adelante 5'-ATCCTCTGCATGGTCAGGTC-3 ' , transgén inversa 5'-CGTGGCCTGATTCATTCC-3 ' ; control positivo interno hacia adelante 5'-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3 ' , positivo interno control de revertir 5'-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3 ' . Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Severance, Yonsei University College of Medicine (09-013).
Cuantitativa Histomorfometría
Fases del ciclo del pelo, y se distribuyeron como se describe [24] por medio de histología cuantitativa. Histomorphomety se realizó con secciones de hematoxilina y eosina-manchado (H & E) que fueron tomadas de las regiones definidas de nuevo en la piel. Se evaluaron al menos 50 folículos pilosos por ratón por grupo.
Cultivo Celular
Células de la papila dérmica Humanos se obtuvieron del Dr. Jin-Ho Jung en el Departamento de Dermatología de la Universidad Nacional de Seúl, y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% (vol / vol) de suero bovino fetal (FBS) y suplementado con G418 0,1 mg / ml (Gibco-BRL). Las células se colocaron en placas a una densidad de 6 × 10 5 células por placa de 10 cm de diámetro.
Análisis de transferencia Western
Las células o tejido que se molió en morteros se lisaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,2, 0,1% de sodio dodecil sulfato (SDS), 1,0% de Triton X-100, desoxicolato de sodio al 1%, EDTA 5 mM) . Las muestras fueron separadas en 10-12% SDS geles de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa PROTRAN ® (Schleicher y Schuell Co.). Después de bloquear en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 5% de leche sin grasa seca desnatada y 0,07% (vol / vol) de Tween 20, los blots se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C: anti-β-catenina ( Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), p-ERK (Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), p-Akt (Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), fillagrin (Covance, Berkeley, CA, 1:1000), loricrina ( Covance, 1:1000), queratina 14 (Covance, 1:1000), α-tubulina (Oncogene Research Products, 1:5000), PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes, Santa Cruz Biotechnology, 1:500), BMP4 (I + D sistemas, 1:500), y ALP (Abcam, 1:100). Anti-ratón (Señalización Celular) y anti-conejo (Bio-Rad) anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante se usaron como anticuerpos secundarios. Las señales se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham Bioscience) usando un analizador de imágenes luminiscentes, LAS-3000 (Fujifilm).
La transcripción inversa (RT)-PCR
Se preparó ARN total utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) y el ADNc se sintetizó in vitro utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen). PCR se realizó con Taq ADN polimerasa utilizando un sistema 2700 (Applied Biosystems) a 94 ° C durante 5 min, seguido de 25-30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 55-60 º C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y se fotografiaron usando un analizador de LAS-3000. Se utilizaron los siguientes conjuntos de cebadores: filagrina, adelante 5'-GCTTAAATGCATCTCCAG-3 ' y revertir 5'-AGTCAGTCCTATTGCAGG-3 ' ; loricrina, adelante 5'-CCTACCTGGCCGTGCAAG-3 ' y revertir 5'-CATGAGAAAGTTAAGCCCATCG-3 ' ; queratina 14, adelante 5'-GGACGCCCACCTTTCATCTTC 3 ' y revertir 5'-ATCTGGCGGTTGGTG GAGG-3 ' ; GAPDH, adelante 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' y revertir 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ' ; BMP4, adelante 5'-AGCAGCCAAACTATGGGCTA-3 ' y revertir 5'-TGGTTGAGTTGAGGTGGTCA-3 ' ; BMP6, adelante 5'-AACCAACCACGCGATTGTG-5 ' y revertir 5'-AAGTCTCATCGTCCCACCTC-3 ' , y ALP, adelante 5'-CAAACCGAGATACAAGCACTCCC-3 ' y revertir 5'-CGAAGAGACCCAATAGGTAGTCCAC-3 ' .
Figura 1. Efectos de VPA y MNX en el nuevo crecimiento, etapa del ciclo del pelo del pelo en la piel del ratón.
La piel de la espalda, de 7 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó y se trata a diario con la aplicación tópica de vehículo, 500 mM de ácido valproico (VPA) o minoxidil 100 mM (MNX) durante 28 d. (A) las imágenes brutas que muestran el crecimiento de cabello en ratones C3H tratados con VPA o MNX durante 28 d (panel superior) y la tinción H & E de la piel tratada con MNX VPA o durante 28 d (panel inferior). (B) analiza histomorphometic cuantitativa de los tejidos de la piel tratadas con VPA o MNX de 28 d se realizaron con 5 ratones de cada grupo; anagen temprano, anagen I-anagen II; anagen Media, anagen III-IV; Late anágena, anágena V anágeno VI; catagen Temprana, catagen I-catagen III; catagen Media, catagen IV-V; Late catágeno catagen VI-VIII catagen. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre los grupos control y de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001. Ampliación original: A, × 100 (H & E tinción).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g001
Figura 2. Efectos de VPA y MNX sobre marcadores de diferenciación epidérmica, actividades de ALP y marcadores de células madre foliculares de pelo.
La piel de la espalda, de 7 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó y se trata a diario con la aplicación tópica de vehículo, 500 mM de ácido valproico (VPA) o minoxidil 100 mM (MNX) durante 7 días o 28 d. (A) El análisis inmunohistoquímico de la epidermis de ratones C3H tratados con VPA o MNX durante 28 d con un anticuerpo contra β-catenina, filagrina, loricrina, queratina 14, p-Erk, p-Akt, o PCNA. (B) El análisis inmunohistoquímico de la expresión de β-catenina en los folículos pilosos (panel superior) y la tinción de ALP (panel inferior) del tratado con vehículo, VPA, o MNX durante 7 días la piel. Región azul oscuro en las papilas dérmicas de los folículos pilosos (una flecha roja en el panel del medio) representan positividad para la actividad ALP. (C) El análisis inmunohistoquímico se realizó con anti-queratina 15, o-CD34 anticuerpo. Ampliación original: A, × 635; B, × 635 (inmunohistoquímica) y × 400 (tinción ALP); C, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g002
Figura 3. Efectos de VPA y MNX sobre el estado de activación de la / β-catenina vía Wnt y la actividad de ALP en las células de la papila dérmica humanos.
Células de la papila dérmica Humanos en el paso 11 con una mínima actividad ALP se utilizaron para probar la capacidad de VPA y MNX para recuperar la actividad de ALP. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, G418 (100 mg / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y la penicilina G sódica (100 mg / ml) en 5% de CO 2 a 37 ° C, y tratados con VPA 1 mM o 100 mM MNX para 72 h. (A) Western blot para β-catenina, BMP4, ALP y α-tubulina. (B) La tinción inmunocitoquímica con anticuerpos contra la β-catenina o BMP4. (C) ALP tinción. La morfología celular (paneles de la izquierda) se examinó bajo un microscopio de campo claro. La tinción con azul oscuro indica células ALP-expresión (paneles de la derecha). (D) de Western blot para β-catenina, BMP4, ALP, y α-tubulina en las células de la papila dérmica humanos tratados con VPA o noggin (500 ng / ml). (E) de Western blot para β-catenina, BMP4, ALP, y la expresión de α-tubulina en las células de la papila dérmica humanos tratados con Wnt3a (200 o 40 ng / ml), BMP4 (100 o 20 ng / ml), o EGF (100 o 20 ng / ml) durante 72 h. (C) actividad de la ALP se midió como se describe en Métodos después del tratamiento con Wnt3a (200 ng / ml), BMP4 (100 ng / ml), o EGF (100 ng / ml) durante 72 h. Los asteriscos indican diferencias significativas entre el control y el grupo de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05 y dos asteriscos siendo p <0,005. Ampliación original: B, × 635; C, × 100.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g003
Figura 4. Efectos de la Wnt / β-catenina activadores de la vía sobre el crecimiento de cabello en la piel del ratón.
El vehículo, VPA 500 mM, MNX 100 o derivados de VPA (PBA 500 mM, EBA 500 mM) se aplica tópicamente a lomo afeitado de la piel de los ratones C3H al día durante 28 d. (A) las imágenes brutas de re-crecimiento del cabello (primer panel de fila), inmunohistoquímica de la piel tratada con la droga con un anticuerpo contra β-catenina (segundo panel de fila), y la tinción H & E de la piel tratada con las drogas (panel tercera fila). (B) Se realizaron análisis histomorfométricos Cuantitativos para 5 ratones de cada grupo. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre el control y el grupo de prueba, medida por la prueba t con una asteriscos siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001. Ampliación original: A, × 100 (tinción H & E) y × 635 (inmunohistoquímica).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g004
Figura 5. Efectos de la Wnt / β-catenina activadores de la vía en la regulación de BMP y la actividad de la fosfatasa alcalina.
Células de la papila dérmica Humanos en el paso 11 con una mínima actividad ALP se utilizaron para probar la capacidad de recuperar la actividad de ALP. (A) Morfología (paneles superiores) y los patrones de tinción de fosfatasa alcalina (paneles inferiores) de células de la papila dérmica humanos tratados con VPA 1 mM, 1 mM de PBA, 1 mM de EBA. Las células se observaron bajo campo claro. (B) transferencia de Western para β-catenina, ALP, o la expresión de α-tubulina en los extractos preparados a partir de células de papila dérmica humana tratados con el fármaco. (C) Análisis de RT-PCR de BMP4, BMP6, ALP, y la expresión de GAPDH utilizando ARN total preparado a partir de células de papila dérmica humana tratados con el fármaco. (D) actividad de ALP. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre el control y el grupo de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005. Ampliación original: B, × 100.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g005
Figura 6. Efectos de VPA o MNX sobre el crecimiento del cabello inducida por lesión.
Cuatro escisiones de grosor completo (0,2 cm 2 heridas circulares) de la piel se hicieron sobre las espaldas de C3H 8 semanas de edad o TOP-Gal ratones transgénicos, y VPA 500 mM mM o MNX 100 se aplican por vía tópica diaria a las heridas. (A) las imágenes brutas de representante heridos espalda piel de ratones C3H 25 d después de la aplicación del fármaco. (B) tinción H & E de la piel herida tratados con VPA o MNX. (C, D) de transferencia Western (C) e inmunohistoquímicos (D) análisis de β-catenina, filagrina, loricrina y la queratina 14 en las heridas. Pieles (E) heridos fueron tratados con vehículo, VPA, o MNX por 14 días, y el tejido se sometieron a ensayos de tinción de fosfatasa alcalina. Análisis (F) inmunohistoquímica se realizó con anti-queratina 15, o-CD34 anticuerpo. Ampliación original: B, × 200; C, × 635; D, × 200, E, × 200, F, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.g006
La inmunohistoquímica
Tejidos de la piel se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4%. Secciones de parafina (4 m de espesor) se deparaffinized y rehidratada. Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se trataron en autoclave en mM tampón de citrato de sodio 10. Las secciones se pre-incubaron en PBS y después se bloquearon en PBS que contenía 5% de albúmina de suero bovino y 1% de suero de cabra a temperatura ambiente durante 30 min. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: anti-β-catenina (BD transducción de laboratorio, 1:100), p-Erk (Cell Signaling, 1:30), p-Akt (Santa Cruz , 01:50),,, (sistemas de PCNA (Santa Cruz, 1:500) filagrina (Covance, 1:500), loricrina (Covance, 1:500), queratina 14 (Covance, 1:500) BMP4 de I + D, 1 : 50), la queratina 15 (Thermo Scientific, CA, 1:200), CD34 (Abcam, 1:30), nestin (BD Bioscience, 1:200), Ki67 (Abcam, 1:500), y la queratina 17 (Abcam , 1:100). Las secciones fueron lavadas con PBS y se incubaron con Alexa Fluor 488 - o Alexa Fluor 555-anticuerpo secundario conjugado de IgG (Molecular Probes, 1:400) a temperatura ambiente durante 1 h y a contratinción con DAPI (4 ',6-diamino-2- fenilindol, Boehringer Mannheim, 1:5000). Las señales fluorescentes se visualizaron en un microscopio confocal LSM510 META (Carl Zeiss).
La tinción de fosfatasa alcalina
Células de la papila dérmica Humanos se sembraron en placas de 12 pocillos a 7,5 × 10 4 células por pocillo. Después del crecimiento durante 24 h, las células se trataron con fármacos durante 72 h, y después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min y se lavaron con PBS. Para la tinción óptima, las células se enjuagaron en tampón TN (0,1 M de Tris-HCl, NaCl 0,1 M, pH 9,5). Las células se incubaron en 120 tetrazolio g / ml 4-nitroazul y 60 mg / ml de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolylphophate) en tampón TN durante 30 min. La reacción se detuvo mediante lavado con PBS, y las células se examinaron bajo un microscopio de campo brillante. La tinción con azul oscuro indica señal positiva para ALP. Para la tinción de ALP de los tejidos, criosecciones 10-M se incubaron con BCIP y se analizaron como anteriormente. Actividad de la ALP se midió a 405 nm por FLUOstar OPTIMA luminómetro.
X-gal tinción de tejidos
Tejido de la piel fresca se fijó en 4% paraformaldehido durante la noche y luego incorporados en el tejido compuesto Tek octubre (Sakura Finetechnical). Criosecciones (10-M) se prepararon en portaobjetos recubiertos y utilizados para X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactop yranoside, Oro Biotecnología) tinción. Las secciones se fijaron con 0,2% glutaraldehído durante 5 min, se lavaron con PBS durante 5 min, y se incubaron en una solución 1 mg / ml de X-gal durante 24 h a temperatura ambiente en un ambiente húmedo. Los portaobjetos se lavaron durante 5 min con PBS, se enjuagaron con agua destilada, y se contratiñeron con Nuclear Fast Red durante 5 min.
Resultados
Ácido valproico promueve el crecimiento de cabello e induce diferenciación terminal Marcadores Cabello en Vivo
Pusimos a prueba la actividad de crecimiento de cabello de LiCl y VPA, dos activadores químicos de la Wnt / β-catenina vía [25] , [26] . VPA o LiCl se aplicó por vía tópica diaria sobre las espaldas de ratones C3H a diferentes concentraciones para determinar la concentración óptima para cada agente. MNX se aplicó por separado como un control positivo. Los ratones tratados con 1 M de LiCl o VPA 500 mM mostraron fenotipos de crecimiento del cabello ( Figuras S1A y S1B ). Especialmente, VPA promovió el crecimiento de cabello tan eficientemente como MNX después de 28 d ( Figura 1A ). Los folículos pilosos de los ratones tratados con VPA o MNX entraron en la fase anágena, mientras que los folículos pilosos en el grupo de control tratado con solución de vehículo se mantuvieron en fase telógena ( Figura 1A , los datos para diferentes tiempos de tratamiento de drogas se muestran en la Figura S2 ). Los análisis histomorfométricos demostraron que el VPA promovió telógeno-anágena transición ( Figura 1B ). Especialmente, los folículos del pelo de los ratones tratados con VPA fueron transformados a media o tardía-anágena ( Figura 1B ). El análisis inmunohistoquímico confirmó que la expresión de la filagrina y loricrina se incrementó en un VPA o MNX ( Figura 2A , los datos para los diferentes tiempos de tratamiento de drogas se muestra en las figuras S2B y S2C ). No se observó ningún fenotipos anormales significativos en la epidermis, folículos pilosos, u otras estructuras de la piel aparte de nuevo crecimiento del pelo después de la aplicación de VPA o MNX ( Figura 1A ). En contraste con la epidermis de la piel del ratón tratados con VPA, la piel que se trató con LiCl reveló cambios anormales críticos incluyendo un aumento en el espesor de la epidermis ( Figura S3 ), donde la expresión de la filagrina, loricrina, y la queratina 14 también era anormalmente elevado como se muestra mediante inmunohistoquímica ( Figura S3 ).
Ácido valproico Activa la Wnt / β-catenina vía en adición a las Erk y Akt Pathways
La expresión de β-catenina en la piel de ratones se incrementó significativamente por la aplicación de VPA, pero sólo ligeramente aumentado en MNX ( Figura 2A ). MNX es conocido por promover el crecimiento de cabello a través de las vías de Erk y Akt, que están implicados en la regulación de la proliferación de células de la papila dérmica del folículo piloso [27] . Curiosamente, las actividades tanto de Erk y Akt se mejoraron de manera similar por tratamiento con VPA o MNX ( Figura 2A ). El nivel de expresión del PCNA marcador de proliferación se incrementó mediante la aplicación de VPA o MNX comparación con el control de la piel ( Figura 2A ). Por lo tanto, el VPA hasta regula el / vía de β-catenina Wnt en Además de las vías de Erk y Akt, pero a través de un mecanismo diferente.
Para examinar los efectos a corto plazo de VPA en el crecimiento de cabello, se analizó la piel de ratones C3H después de la aplicación de VPA o MNX durante 7 d. El espesor de la epidermis y aumentó ligeramente el número de folículos pilosos aumentó 7 d después de la aplicación de VPA o MNX ( Figura S4A , panel superior). El análisis inmunohistoquímico mostró que la expresión keratin14 se incrementó después de una aplicación de 7 d de VPA o MNX ( Figura S4A , panel inferior), aunque el nivel de keratin14 no se ha modificado 28 d aplicación de VPA o MNX ( Figura 2A ). Curiosamente, VPA, pero no MNX, aumentó en gran medida la expresión de β-catenina en los folículos pilosos de ratones C3H ( Figura 2B ). También se observó una inducción significativa de ALP en la papila dérmica después de la aplicación de VPA, pero no MNX ( Figuras 2B y S 4B). Por otra parte, se confirmó la activación específica de la / β-catenina vía Wnt en las regiones de la corteza pre- [4] de la piel de ratones reportero TOP-Gal Wnt tratados durante 7 días con VPA, pero no MNX ( Figura S4C ). Curiosamente, la queratina 15 y CD34, los marcadores de células madre foliculares de pelo, fueron inducidos en las células bombeo mediante la aplicación de VPA durante 7 d ( Figura 2C ), pero no por la aplicación de la MSX.
Ácido valproico, pero no MNX, hasta regula la Wnt / β-catenina y ALP actividad en las células humanas papila dérmica
Para identificar si el VPA puede activar el / vía de β-catenina Wnt en sistemas humanos, se utilizó un in vitro sistema de cultivo de células de la papila dérmica humanos. El nivel de expresión de β-catenina se incrementó en gran medida por el tratamiento con VPA, pero no MNX durante 72 h ( Figuras 3A y S 5). Del mismo modo, la expresión tanto de BMP4 y ALP se aumentó por VPA, pero no MNX ( Figuras 3A y S 5). También confirmó la activación significativa de β-catenina y BMP4 en células de la papila dérmica humanos tratados con VPA por inmunocitoquímica, y otra vez que no se observó esos cambios después del tratamiento con MNX ( Figura 3B ). Para evaluar el efecto de VPA o MNX sobre la regulación de la actividad de ALP, hemos utilizado células de la papila dérmica humanos en el paso 11 que mostraron muy débil actividad de la ALP. Se observó un aumento significativo en la actividad de ALP después del tratamiento con VPA, pero no MNX ( Figura 3C ). Por otra parte, la inducción de la actividad de ALP por VPA fue bloqueado por Noggin, un antagonista de BMP4 ( Figura 3D ). Para confirmar el papel de la / vía de β-catenina Wnt en la activación de ALP, que mide los efectos de Wnt3a, BMP4, o factor de crecimiento epidérmico (EGF) ligando en ALP. La expresión de ambas ALP y β-catenina se incrementó significativamente por el tratamiento con Wnt3a o BMP4 de una manera dependiente de la concentración, mientras que estos cambios no fueron inducidos de manera significativa mediante el tratamiento con EGF ( Figura 3E ). La activación específica de ALP por Wnt3a y BMP también se confirmó mediante un ensayo enzimático directo ( Figura 3F ).
Los activadores de la vía Wnt / β-catenina promover el crecimiento de cabello en Vivo
Para confirmar el papel del / β-catenina vía Wnt en el crecimiento de cabello, hemos probado los efectos de los fármacos que regulan el / β-catenina vía Wnt en el pelo vuelva a crecer en ratones. Cloruro de berilio (BeCl 2 ), LiCl (un inhibidor de GSK3 alternativa), y varios derivados de VPA incluyendo el ácido 4-fenil butírico (PBA) y ácido butírico 2-etil (EBA) fueron probados por sus efectos sobre el crecimiento de cabello. PBA o EBA inducen el crecimiento de cabello después de la aplicación tópica en la parte posterior de los ratones C3H de 28 d ( Figura 4 A , primer panel de la fila). Los niveles de β-catenina se incrementaron mediante el tratamiento con PBA, pero no EBA ( Figura 4A , panel de segunda fila). Los folículos pilosos de tejidos de la piel tratados con PBA o EBA entraron en la fase anágena, como se muestra por tinción H & E ( Figura 4A , panel de tercera fila). Análisis histomorfométrico reveló que la PBA y EBA también indujeron transición telógeno anágena ( Figura 4B ). LiCl o BeCl 2 también induce el crecimiento de cabello después de 35 días a pesar de su creciente actividad pelo era suave ( Figura S6A , primer panel de la fila). El tratamiento con LiCl o BeCl 2 aumenta los niveles de β-catenina y ciclo del cabello acelerada en la fase anágena ( Figura S6A , segundo panel de la fila y el panel de tercera fila). Sin embargo, el espesor de la epidermis se aumentó en la piel tratada con BeCl 2 o PBA comparación con el control de la piel, como se describió anteriormente para la aplicación de LiCl. La expresión de la filagrina y la loricrina se incrementó anormalmente por aplicación de BeCl 2 , similar al efecto de LiCl ( Figura S6B ). Sin embargo, las actividades de Erk y Akt se incrementaron en un tratamiento con todos los medicamentos, incluyendo EBA ( Figuras S6C y S7 ).
Actividad de la ALP se aumentó por el tratamiento con VPA o PBA, que también regulado hasta el / β-catenina vía Wnt en la papila dérmica humana ( Figura 5A ). Curiosamente, el tratamiento con EBA, que no afecta a la / β-catenina vía Wnt, no aumentó significativamente la actividad de ALP ( Figura 5A ). Además, se aumentaron los niveles de proteína y de ARNm de ALP después del tratamiento con VPA o PBA, que también aumentó el nivel de proteína de β-catenina, pero no por el tratamiento con MNX o EBA ( Figuras 5B, 5C, y S
. Expresión de ARNm de BMP4 se aumentó por el tratamiento con VPA, pero sólo se incrementó marginalmente por tratamiento con MNX o PBA y no se indujo en absoluto por la ABE. Expresión de BMP6, que induce los efectos más pronunciados sobre la activación de ALP entre las BMPs [28] , se incrementó notablemente por cualquiera de VPA o PBA pero no por MNX o EBA ( Figura 5C ). La activación específica de ALP por VPA o PBA también se confirmó mediante un ensayo enzimático directo ( Figura 5D ). El modelo de ratón mostró fenotipos similares a los observados en las células de la papila dérmica humanos; los niveles de β-catenina en la epidermis y la ALP en papilas dérmicas se incrementaron de manera significativa mediante la aplicación de VPA o PBA durante 7 d, pero no se cambiaron por aplicación de MNX o EBA ( Figuras S9A y S9B ).Ácido valproico promueve el crecimiento del pelo en heridas cutáneas en ratones
La activación de la / vía de β-catenina Wnt en queratinocitos epidérmicos potencialmente puede inducir el crecimiento del pelo en la piel del ratón que está dañado por hiriendo [29] . Para probar la eficacia de VPA en el crecimiento del cabello inducida por lesión, se aplicó diariamente VPA a la zona de la herida (diámetro = 0,5 mm) de ratones C3H. Áreas La presencia de células madre epiteliales en los folículos pilosos alrededor de la herida induce ciclismo pelo espontánea como se informó anteriormente [30] , y VPA mejorado aún más significativamente el crecimiento del cabello ( Figuras 6A y S 10A) y la transición de la fase telógena a la fase anágena en el sitio de la herida según lo revelado por el análisis histológico ( Figura 6B ). Los niveles de expresión de fillaggrin, loricrina, y la queratina 14 en las heridas también se incrementó en concreto mediante la aplicación de VPA durante 14 días tanto por inmunoblot y análisis inmunohistoquímicos ( Figuras 6C y 6D ). Por otra parte, el VPA activa específicamente la vía Wnt / β-catenina durante el crecimiento del pelo en los sitios de la herida, como se muestra por el aumento de la expresión de β-catenina ( Figuras 6C y 6D ) y la inducción de β-galactosidasa en los folículos pilosos recién formadas de reportero TOP-Gal Wnt los ratones ( Figura S10B ; ratones representativos hairg fenotipos de crecimiento por aplicación de la droga se muestran en la Figura S10C ). Es importante destacar que también se observó un aumento en la actividad de la ALP en los folículos del pelo después de la aplicación de VPA ( Figura 6E ). La queratina 15 y CD34, los marcadores de células madre foliculares del pelo, se incrementaron después de 25 días de aplicación de VPA a las heridas ( Figura 6F ).
Discusión
VPA es un fármaco antiepiléptico con frecuencia prescrita por su seguridad y eficacia [10] , [11] . El uso prolongado de VPA dio lugar a varios efectos secundarios como la pérdida de cabello por la ingesta oral; estos efectos adversos se atribuyen al zinc y al agotamiento de biotinidasa [31] . No se observaron efectos de re-crecimiento del cabello cuando VPA se administró oralmente a ratones C57BL / 6 ( Figuras S11a y S11b ). Sin embargo, la aplicación tópica de VPA promovió significativamente la formación de cabello en modelos murinos. Los niveles de β-catenina en la piel de ratones se aumentaron específicamente por aplicación tópica de VPA ( Figura S11C ).
En este estudio, hemos demostrado que los inhibidores de GSK3 que activan la Wnt / β-catenina vía [17] , [18] , [25] , [32] podrían potencialmente desarrollarse como fármacos para tratar la pérdida del cabello y la calvicie que implica defectos en los folículos pilosos . Entre éstos, el VPA fue identificado como el factor de re-crecimiento del cabello más potente sin causar anormalidades de la piel en ratones. Inhibidores alternativos de GSK3, LiCl o BeCl 2 , también estimularon el crecimiento de cabello y regresaron el ciclo del pelo a la fase anágena, pero aumentaron de forma anormal el espesor de la epidermis con hiper-activación de marcadores epidérmicas terminales diferenciadas. En contraste con la epidermis de la piel de ratón tratado con otro inhibidor de GSK3, la piel de los ratones C3H tratados con VPA no puso de manifiesto ninguna fenotipos anormales significativos en la epidermis. Encontramos que la fosfatasa alcalina es un marcador altamente creíble para la activación de la / β-catenina vía Wnt, y la importancia de la / β-catenina vía Wnt en la activación de ALP fue confirmada por la demostración de que la ALP no estaba regulado por la MSX o EBA, que no inducir la expresión de β-catenina y BMP4. Se sabe que el VPA estimula la diferenciación neuronal de células progenitoras neurales a través de la inducción de BMP4 [33] , [34] , y el efecto de BMP4 en la actividad inductor de cabello también se informó anteriormente [28] . Nuestro estudio se informa de que BMP4 juega un papel como un activador de la ALP confirma una vez más la importancia de la / β-catenina vía Wnt en el crecimiento de cabello.
Aunque el efecto relativo fue pequeño en comparación con VPA o PBA, EBA (que no se activó β-catenina y BMP4 o ALP), siendo inducido la formación del pelo. Estos resultados indican que la actividad inductora de pelo de la EBA puede ser independiente de la / β-catenina vía Wnt, y de hecho nos confirmaron que la ABE activación de Erk y Akt, que a su vez participa en la proliferación de queratinocitos inducida. Curiosamente, VPA expresión inducida de los marcadores de células madre foliculares del pelo ketatin 15 y CD34 durante la formación del cabello y el crecimiento inducido por la herida. VPA se sabe que inducen la expresión de CD34 y mejorar stemness [35] , [36] . Los cueros cabelludos calvas de los hombres con alopecia androgenética carecen de CD200-ricos, células progenitoras del folículo piloso CD34-positivo, y tienen un defecto en la conversión de las células madre del folículo piloso a las células progenitoras, que desempeñan un papel en la patogénesis de la alopecia androgenética [37]. Los resultados de nuestro estudio indican que las pequeñas moléculas que activan el / β-catenina vía Wnt, como VPA, potencialmente pueden ser aplicados para el desarrollo de drogas para acelerar el ciclo del cabello y estimular el crecimiento de cabello.
Información de Apoyo
Pelo vuelva a crecer después de la aplicación tópica de LiCl, VPA, o MNX a la piel de ratones. Volver piel de 8 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó, vehículo o varias concentraciones de LiCl, VPA, o MNX se aplicaron tópicamente durante 35 d . (A) Imágenes manifiestas de los ratones tratados con LiCl, VPA, o MNX. (B) las imágenes ampliadas de la piel representante de Figura S1 .
Figura S1.
Pelo vuelva a crecer después de la aplicación tópica de LiCl, VPA, o MNX a la piel de ratones. Volver piel de 8 semanas de edad ratones C3H masculinos se afeitó, vehículo o varias concentraciones de LiCl, VPA, o MNX se aplicaron tópicamente durante 35 d . (A) Imágenes manifiestas de los ratones tratados con LiCl, VPA, o MNX. (B) las imágenes ampliadas de la piel representante de Figura S1 .
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s001
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Figura S2.
Efectos de VPA o MNX en β-catenina, la diferenciación epidérmica, y marcadores de proliferación en la piel del ratón. ratones C3H fueron tratados con VPA o MNX de 7, 14, o 21 d. Tinción de H & E y los análisis inmunohistoquímicos se realizaron como se describe en la Figura 1 y 2 . Ampliación original: H & E, x 200; inmunohistoquímica, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s002
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Figura S3.
Efectos de LiCl en marcadores de diferenciación epidérmica, β-catenina, PCNA y actividades de Erk y Akt en la piel del ratón. tejido de la piel tratada con LiCl se escindió y se sometieron a tinción H & E, la tinción de ALP, o el análisis inmunohistoquímico para la detección de la filagrina, loricrina, keratin14 , β-catenina, p-Erk, p-Akt, y PCNA como se describe en las Figuras 1 y 2 . Ampliación original: H & E, × 100; inmunohistoquímica, × 635; tinción ALP, × 200.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s003
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Figura S4.
Efectos de VPA o MNX sobre la expresión de keratin14, ALP o β-galactosidasa actividades de vigilancia de las actividades de Wnt / β-catenina en ratones piel. ratones C3H fueron tratados con VPA o MNX durante 7 d. (A) tinción H & E (panel superior) y el análisis de inmunohistoquímica para queratina 14 (panel inferior) en la piel tratada. (B) tinción ALP de control, VPA-o de la piel de ratones tratados con la MSX. (C) TOP-GAL tejidos ratones transgénicos tratados con vehículo, VPA, o MNX durante 7 días fueron sometidos a la tinción con X-gal para examinar la regulación de la / β-catenina vía Wnt. Región azul de los folículos pilosos de IMDb para la señalización de Wnt / β-catenina positivo. Ampliación original: A, × 100; B, × 200; C, × 400 (panel izquierdo) y × 200 (panel derecho).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s004
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Figura S5.
Efectos de VPA y MNX sobre el estado de activación de la / β-catenina vía de Wnt y ALP en células de la papila dérmica humanos. células de la papila dérmica humanos se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor y fueron tratados con VPA 1 mM o 100 M MNX durante 72 h. Western Blot se realizó en células de la papila dérmica humanos tratados con VPA o MNX. La expresión relativa de cada proteína, tal como β-catenina, BMP4, y ALP se calculó como la relación de cada nivel de expresión de la proteína a nivel de α-tubulina. El software utilizado para la cuantificación fue multi-Gauge V 3.0 (Fujifilm). Los asteriscos denotan diferencias significativas entre los grupos control y de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s005
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Figura S6.
Efectos de la Wnt / β-catenina activadores de la vía sobre el crecimiento de cabello en la piel del ratón. La piel de la espalda de los ratones C3H se afeitó y se trata con la aplicación tópica de vehículo, inhibidor de GSK3 alternativa (1 M LiCl, mM BeCl 200 2 ) al día durante 35 d. (A) las imágenes brutas de re-crecimiento (primer panel fila) el pelo, la inmunohistoquímica de LiCl o BeCl 2 piel tratada con anticuerpo contra β-catenina (segundo panel de fila), y la tinción H & E de LiCl o BeCl 2 piel tratada (tercera panel de fila). (B) El análisis inmunohistoquímico de la filagrina, loricrina y keratin14 en LiCl o BeCl 2 piel tratada. (C) El análisis inmunohistoquímico de p-Erk y p-Akt en LiCl o BeCl 2 piel tratada. Ampliación original: A, × 100 (tinción H & E) y × 400 (inmunohistoquímica), B, × 635; C, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s006
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Figura S7.
Efectos de VPA, MNX y derivados de VPA en marcadores de diferenciación epidérmica en la piel del ratón. La piel de la espalda de los ratones C3H se afeitó y tratado con una aplicación tópica del vehículo, VPA 500 mM, 100 mM MNX, o derivados de VPA (PBA 500 mM , 500 mM EBA) al día durante 28 d. El análisis inmunohistoquímico de la filagrina, loricrina, keratin14, β-catenina, p-Erk, p-Akt, y PCNA en la piel tratada con las drogas. Ampliación original: × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s007
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Figura S8.
Efectos de Wnt / β-catenina activadores de la vía en el estado de activación de la / β-catenina vía de Wnt y ALP en células de la papila dérmica humanos. células de la papila dérmicos humanos fueron tratadas con VPA 1 mM, 100 mM MNX, 1 mM de PBA, o 1 EBA mM durante 72 h. La expresión relativa de β-catenina o ALP se calculó como la relación de cada nivel de la proteína a nivel de α-tubulina. El software utilizado para la cuantificación fue multi-Gauge V 3.0 (Fujifilm). Los asteriscos indican las diferencias significativas entre los grupos control y de prueba, medida por la prueba t con un asterisco siendo p <0,05, dos asteriscos siendo p <0,005, y tres asteriscos siendo p <0,0001.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s008
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Figura S9.
Efectos de VPA, MNX, PBA, y EBA en la activación de Wnt / vía de β-catenina, la actividad de ALP in vivo. Después de la aplicación tópica de VPA 500 mM, 100 mM MNX, PBA 500 mM, o EBA 500 mm sobre las espaldas de los ratones C3H de 7 d, el tejido de la piel se ha escindido del área tratada para inmunohistoquímica y tinción ALP. (A) La tinción inmunohistoquímica para β-catenina o queratina 14. (B) El análisis inmunohistoquímico de β-catenina (panel superior) y la tinción de ALP (panel inferior) de los folículos pilosos de tratados con vehículo, VPA, MNX, PBA, o EBA piel. Regiones de color azul oscuro en la papila dérmica de los folículos pilosos (flechas rojas) representan la tinción positiva para la actividad ALP. Ampliación original: A, × 635; B, × 635 (inmunohistoquímica) y × 400 (tinción ALP).
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s009
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Figura S10.
Efectos de VPA y MNX sobre el crecimiento del cabello inducida por lesión y la activación de la / β-catenina señalización Wnt in vivo . Cuatro escisiones de piel de espesor (0,2 cm 2 heridas circulares) se hicieron sobre las espaldas de ratones C3H 8 semanas de edad , y VPA mM o 500 mM de MNX 100 se aplicó por vía tópica diaria. (A) Imágenes manifiestas de la piel herida dorso de ratones C3H 25 d después de la aplicación de la droga. Paneles de la derecha están ampliadas de imágenes representativas. (B) pieles heridos en ratones transgénicos TOP-GAL fueron tratados con vehículo, VPA, o MNX de 14 d, y el tejido se sometió a tinción con X-gal. (C) las imágenes brutas de la piel herida dorso de ratones TOP-gal 14 d después de la aplicación de los medicamentos. Ampliación original: B, × 200.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s010
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Figura S11.
Efectos de VPA o MNX por administración oral en el crecimiento de cabello. (A) Imágenes manifiestas de C57BL / 6 ratones por vía oral administrados por VPA o MNX. La piel de la espalda de ratones C57BL / 6 se afeitó y VPA o MNX se administró por vía oral a una dosis de 200 mg / kg para el 35 d. (B) Tinción H & E de la piel de ratones se administró oralmente o por vía tópica aplicada por VPA. VPA se administró por vía oral a una dosis de 200 mg / kg o por vía tópica aplicada a 500 mM durante 35 d. (C) El análisis inmunohistoquímico de β-catenina, filaggirn, loricrina y keratin14 piel en ratones por vía oral o tópica aplicada por VPA. Ampliación original: B, × 100; C, × 635.
doi: 10.1371/journal.pone.0034152.s011
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Topico:
Bimatoprost/Indometacina bajo DMSO. Lunes a Viernes 1/Aplic.Día.
MG132. 21 días de aplicación/7 días de descanso 1/Aplic.Noche.
Oral:
Dutasteride 0,125 mg Lunes,Miercoles y Viernes/Noche.
Terapia de Quelación. 1 cada 10 Días.
Autohemoterapia. 1 cada 5/7 Días.
Bimatoprost/Indometacina bajo DMSO. Lunes a Viernes 1/Aplic.Día.
MG132. 21 días de aplicación/7 días de descanso 1/Aplic.Noche.
Oral:
Dutasteride 0,125 mg Lunes,Miercoles y Viernes/Noche.
Terapia de Quelación. 1 cada 10 Días.
Autohemoterapia. 1 cada 5/7 Días.
, pero me acuerdo que mi abuela(QEPD) usaba el valcote y tenia entendido que vía oral causaba caida de cabello no? tenes idea de esto? porque a mi el medico me lo iba a recetar y automaticamente le pedi otra tipo de farmaco que no cause calvicie(creo que lo hable con vos por mp). Vuelvo a repetir , pinta muy interesante el estudio.
interesant!