[nahirbus]

Abstracto:
Estudios recientes sugieren que la alteración de andrógenos impulsado a los factores autocrinos y paracrinos producidos por papila dérmica cuero cabelludo (DP) las células pueden ser una clave a la calvicie de andrógenos potenciada. Aquí, hemos examinado la dihidrotestosterona (DHT genes) regulados en la calvicie células DP y encontramos que dickkopf 1 (DKK-1) es uno de los genes más sobreexpresados. DKK-1 ARN mensajero es aumentada en 3-6  horas después de 50-100  n m tratamiento DHT y ELISA mostró que DKK-1 es secretada por las células DP en respuesta a DHT. Un sistema de co-cultivo utilizando vaina externa de la raíz (ORS) queratinocitos y células DP mostró que la DHT inhibe el crecimiento de las células ORS, y anticuerpos neutralizantes contra DKK-1 invirtió significativamente la inhibición del crecimiento de las células ORS. Análisis de las células ORS co-cultivadas mostró un incremento significativo de las células apoptóticas sub-G1 en respuesta a DHT. También, DKK-1 recombinante humana inhibe el crecimiento de células de SRO y provocó la muerte celular por apoptosis. Además, la muerte celular epitelial inducida por DHT en los folículos pilosos cultivadas se invirtió mediante la neutralización de DKK-1 anticuerpo. Por otra parte, la inmunotransferencia mostró que el nivel de DKK-1 es en el cuero cabelludo calvo en comparación con el cuero cabelludo de pelo de los pacientes con alopecia androgenética. En conjunto, nuestros datos sugieren fuertemente que la DHT-inducible DKK-1 está implicada en la calvicie de DHT-impulsado.
La papila dérmica (DP), un grupo de fibroblastos especializados, se cree que las proteínas difusibles secretas que regulan el crecimiento y la actividad de las diversas células en el folículo, por lo tanto juega un papel clave en la regulación del ciclo del pelo y el crecimiento (revisado por Millar , 2002 ; Botchkarev y Kishimoto, 2003 ). El DP se encapsula por las células de la matriz epiteliales suprayacentes, y se cree que los factores de crecimiento de DP para causar que las células epiteliales a proliferan y se diferencian para producir tallo del cabello durante la fase anágena (revisado por Botchkarev y Kishimoto, 2003 ). Transición anágeno-a catágena se sabe que está impulsado por factores tales como factor de crecimiento transformante- β 1 (TGF- β 1) y el TGF- β y 2 caracterizado por la muerte celular apoptótica en células epiteliales en el bulbo piloso y la vaina externa de la raíz ( ORS) ( Soma et al. , 1998 ; Inui et al. , 2002 ; Soma . et al , 2002 ; Peters . et al , 2005 ).

La alopecia androgenética (AGA), o calvicie de patrón masculino, es el tipo más común de pérdida de cabello en los hombres. Una de las características clave de la AGA es la reducción progresiva en la duración de la fase anágena (revisado por Kaufman, 2002 ). En otras palabras, los folículos se someten a la transición desde la fase anágena a la prematura inducida por andrógenos (catágena Jahoda, 1998 ). Otra característica es la miniaturización folicular, en el que grandes pelos terminales se transforman en-vellosos como pelos ( Rushton et al. , 1991 ). Aunque el mecanismo patogénico molecular de AGA no está claro, la dihidrotestosterona (DHT) la dependencia de AGA se demostró por la ausencia de la calvicie en los hombres con deficiencia genética de tipo II 5 α -reductasa, que convierte la testosterona en DHT ( Imperato-McGinley et al. , 1974 ; Kuttenn et al. , 1979 ). También, los efectos del tratamiento de la finasterida, un inhibidor selectivo de tipo II 5 α -reductasa, en AGA apoyan la dependencia de la DHT de AGA ( Drake et al. , 1999 ).

Andrógenos circulantes, incluyendo DHT, entran en el folículo a través de los capilares de la DP, se unen al receptor de andrógenos (AR) dentro de las células DP, y luego activan o reprimen genes diana ( Randall et al. , 1994 ). De hecho, las células DP cultivadas de cuero cabelludo calvo secretan TGF- β 1 / TGF- β 2, que inhibe el crecimiento de células epiteliales en respuesta a los andrógenos ( Inui et al. , 2002 ; Hibino y Nishiyama, 2004 ). Además, las células DP frontales calvicie, que contienen menos AR co-activador ARA70 β / ele1 β ( Lee et al. , 2005 ), pero más AR y tipo II 5 α -reductasa que las células DP occipitales no calvicie ( Hibberts et al. , 1998 ; Itami y Inui, 2005 ), se sabe que secretan factores autocrinos inhibitorios, que afectan el crecimiento de las células DP ( Hamada y Randall 2006 ). En conjunto, los datos publicados sugieren fuertemente que la DHT impulsado por alteración de los factores autocrinos y paracrinos puede ser una clave a la calvicie de andrógenos potenciada.

En este estudio, identificar los factores responsables de la calvicie, que exhibió genes-DHT inducible en células DP calvo mediante microarrays de cDNA y encontramos que dickkopf 1 (DKK-1) es uno de los genes más sobreexpresados. DKK-1 inducción en respuesta a la DHT se investigó adicionalmente por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) y ELISA. Uso de la in vitro sistema de co-cultivo ( Itami et al. , 1995a ), se examinaron los efectos de DHT-inducible DKK-1 sobre el crecimiento de los queratinocitos ORS. También se investigaron los efectos de la humana recombinante DKK-1 (rhDKK-1) sobre el crecimiento de las células ORS. Por otra parte, se analizó DKK-1 de expresión en la calvicie y no calvicie del cuero cabelludo de pacientes con AGA.
Resultados:
detección de microarrays de cDNA de genes-DHT inducible en células calvo DP
Con la esperanza de identificar factores estimulantes responsables de la calvicie androgénica potenciada, decidimos detectar genes upregulated en respuesta a DHT de calvicie células DP por cDNA microarray. En primer lugar, se determinó la expresión de AR en las células cultivadas a partir de DP calvicie del cuero cabelludo. La tinción inmunocitoquímica mostró una fuerte expresión de AR en las células DP temprana de paso ( Figura 1c y e ). Sin embargo, la expresión de AR fue muy baja en células DP tardía de paso ( Figura 1g ). De acuerdo con esta observación, se observó que el ARN mensajero AR (ARNm) nivel disminuyó gradualmente durante el subcultivo ( Figura 1i ). Por ello, utilizó temprana paso (P2-P5) células DP en este estudio. Células DP cultivadas fueron tratados con diferentes concentraciones fisiológicas de DHT (1, 10 y 100 n m ) o el control del vehículo (etanol) durante 6 horas y se realizó el análisis de microarrays. Se regula Un número de genes en respuesta a 100 N m DHT, mientras que hubo poca respuesta a las 1 y 10 N m concentraciones de DHT. Los 30 principales genes sobreexpresados ​​se muestran en la Tabla S1, de los cuales nos hemos centrado en DKK-1 para estudios posteriores.    
Discusión:
En respuesta a los andrógenos, DP segrega factores difusibles que afectan epitelio folicular positiva o negativamente. Por ejemplo, el IGF-1 secretada a partir de células DP barba mostró un efecto estimulante sobre los queratinocitos en un modelo de co-cultivo ( Itami et al. , 1995b ). Por otra parte, el TGF- β 1 secretado a partir de la calvicie células DP inhibió el crecimiento de queratinocitos in vitro ( Inui et al. , 2002 ). Con la esperanza de identificar nuevos autocrina y / o paracrina factores responsables de la inhibición del crecimiento de pelo en AGA, se realizó el cribado de cDNA microarray y se encontró que un número de genes están regulados en la calvicie células DP en respuesta a 100 N m DHT. De acuerdo con el informe de Hibino y Nishiyama (2004) , encontramos que el TGF- β 2 es uno de los genes regulados positivamente. Genes diferencialmente upregulated listados en la Tabla S1 puede ser vale la pena investigar para una mayor comprensión de la patogénesis de la AGA. 

Entre los genes regulados positivamente en respuesta a DHT, nos centramos en DKK-1, que codifica una endógeno potente y específico antagonista Wnt secretada ( Bafico et al. , 2001 ) que se une e inhibe la lipoproteína de baja densidad de receptores relacionados con la proteína-co-receptores requeridos para canónica de señalización Wnt implicadas en la inducción de pelo y el crecimiento ( Chiang et al. , 1999 ; Millar . et al , 1999 ; Kishimoto . et al , 2000 ; Shimizu y Morgan, 2004 ). Hemos observado que DKK-1 es inducida en cinco de siete culturas DP obtenidos a partir de los folículos pilosos del cuero cabelludo calvo de diferentes individuos con AGA. DKK-1 mRNA se upregulated significativamente el plazo de 3-6 horas después de 50-100 n m tratamiento DHT. Además, la secreción de DKK-1 por la DHT se demostró claramente mediante ELISA. DKK-1 era conocido previamente a ser inducida por una variedad de estímulos, incluyendo los rayos UV, H 2 O 2 , cisplatino, β -péptido amiloide, y los glucocorticoides ( Shou y col. , 2002 ; Caricasole . et al , 2004 ; Ohnaka y col . , 2004 ). Sin embargo, para nuestro conocimiento, DKK-1 inducción por andrógenos no se ha reportado previamente.  

En este estudio, también se observó que la DHT suprimió significativamente el crecimiento de las células ORS en co-cultura y que la neutralización de anti-DKK-1 anticuerpos de inhibición del crecimiento inducida por DHT-atenuada significativamente de las células ORS. Estos datos sugieren que DKK-1 es de hecho implicada en la supresión del crecimiento inducida por DHT-de las células ORS en co-cultivo. Además, se observó que el neutralizador anti-DKK-1 anticuerpo invirtió la muerte celular inducida por DHT-en las células epiteliales cultivadas en los folículos pilosos. Estos resultados sugieren que la DHT induce DKK-1 de DP de los folículos pilosos y que la muerte de la célula epitelial es debido en gran parte a DKK-1. Nuestros datos están de acuerdo con el papel de DKK-1 en las interacciones epitelio-mesénquima en tejidos adultos ( Reddy et al. , 2001 ) y son consistentes con el reciente informe del Andl et al. (2002) quienes encontraron que los ratones que expresan niveles elevados de DKK-1 en la piel mostrar un bloque temprano y completo en el desarrollo de los folículos pilosos.

Medición de contenido de ADN en las células ORS co-cultivadas mostró que las células sufren apoptosis en presencia de DHT como se evidencia por el incremento de células sub-G1-fase, lo que sugiere que DKK-1 induce la apoptosis en las células ORS. Esto es apoyado por el incremento de las células ORS TUNEL-positiva en respuesta a rhDKK-1. Estos resultados están de acuerdo con el papel proapoptótico de DKK-1 ( Wang et al. , 2000 ; Grotewold y Ruther, 2002 ; Shou . et al , 2002 ; Peng . et al , 2006 ) y están en consonancia con la expresión de DKK -1, que se solapa con los sitios de la muerte celular programada durante el desarrollo de las extremidades ( Mukhopadhyay et al. , 2001 ) y la muerte neuronal isquémica ( Cappuccio et al. , 2005 ).

Nuestros datos de este estudio proporcionan evidencia preliminar de que la DHT-inducible DKK-1 producido por la calvicie células DP promueve la apoptosis de los queratinocitos foliculares vecinos in vitro . Estos datos, junto con la mayor expresión de DKK-1 en el cuero cabelludo calvo en comparación con el cuero cabelludo de pelo, sugieren que DKK-1 puede ser uno de los factores clave implicados en la patogénesis de la AGA. Sin embargo, todavía queda por investigar si nuestras observaciones se traducen en un papel significativo para DKK-1 en la disminución del crecimiento del folículo piloso y en última instancia en AGA.